Ministerio
de Salud y Acción Social
SALUD PUBLICA
Resolución 288/90
Apruébase la Regulación Técnica para
Control de Productos Higiénicos Descartables de Uso Externo e
Intravaginal.
Bs. As. 28/11/1990
VISTO el TRATADO DE INTEGRACION, COOPERACION y DESARROLLO firmado con
la REPUBLICA FEDERATIVA DEL BRASIL y la necesidad de regularizar y
normatizar la importación, exportación, calidad de la materia prima,
condiciones de elaboración, fraccionamiento y comercialización de
absorbentes descartables; y
CONSIDERANDO:
Que los productos absorbentes descartables son usados sobre superficies
corporales vulnerables a infecciones y otras lesiones dermatológicas.
Que se hace necesario contar con los servicios de Laboratorio Químico
Microbiológico y Farmacológico que permitan el estricto control de los
valores establecidos, para todos y cada uno de los parámetros
involucrados.
Que en el marco del Protocolo IV del acuerdo bilateral citado se
elabora una propuesta de regulación única para el control de productos
absorbentes higiénicos de uso externo e intravaginal, con participación
de autoridades y representantes de este MINISTERIO.
Que dicha propuesta constituye un avance en los programas de
integración argentino-brasileño y, a su vez, implica el
perfeccionamiento de la normativa vigente, adecuándose a los avances
científicos producidos en el tema.
Que la DIRECCION DE ASUNTOS JURIDICOS de la ex SECRETARIA DE SALUD no
formula objeciones al respecto.
Que la DIRECCION GENERAL DE ASUNTOS JURIDICOS ha tomado la intervención
de su competencia.
Que la presente resolución se dicta en uso de facultades conferidas por
el Artículo 40 del Decreto Nº 9763/64 reglamentario de la Ley Nº 16.463.
Por ello,
EL MINISTRO DE SALUD Y ACCION SOCIAL
RESUELVE:
Artículo 1º - Apruébase la REGULACION TECNICA PARA CONTROL DE
PRODUCTOS HIGIENICOS DESCARTABLES DE USO EXTERNO E INTRAVAGINAL que
como Anexos
I, II y III forma parte de la presente.
Art. 2º - Derógase la Resolución Nº 1068, del 14 de abril de
1980.
Art. 3º - Dispónese un plazo de NOVENTA (90) días a fin de que
los
Establecimientos alcanzados por la presente se adecuen a esta
eglamentación.
Art. 4° - Las infracciones a la presente resolución serán
sancionadas conforme lo reglado por la Ley Nº 16.463.
Art. 5° - Regístrese, comuníquese y archívese, previa publicación. -
Alberto A. Kohan.
REGULACIÓN TÉCNICA PARA CONTROL DE PRODUCTOS ABSORBENTES HIGIÉNICOS
DESCARTABLES, DE USO EXTERNO E INTRAVAGINAL
ANEXO I
PRODUCTOS DESCARTABLES DE USO EXTERNO
1. Definición
1.1. Son considerados productos absorbentes descartables de uso
externo, los artículos destinados al aseo corporal, aplicados
directamente sobre la piel, con la finalidad de absorber o retener
excreciones o secreciones orgánicas, tales como orina, heces, leche
materna y las excreciones de naturaleza menstrual e intermenstrual.
1.2. Están comprendidos en este grupo los absorbentes higiénicos
femeninos de uso externo, los pañales para bebé, pañales para adultos y
los absorbentes de leche materna.
2. Composición
Los productos absorbentes descartables de uso externo, están compuestos
por:
2.1. Una capa de tela polimérica que permita el pasaje de fluidos
orgánicos y que retenga las heces.
2.2. Un núcleo absorbente destinado a almacenar fluidos orgánicos que
atraviesen la primera capa, compuesto por algodón hidrófilo, pulpa de
celulosa virgen o materiales poliméricos absorbentes.
2.3. Una capa de apoyo estructural.
3. Requisitos de Calidad
3.1. Las materias primas presentes en la composición de estos productos
deberán ser de naturaleza atóxica y, para su confirmación serán
sometidas obligatoriamente a los siguientes ensayos: IRRITACION
PRIMARIA Y SENSIBILIZACION. Estos ensayos se efectuarán para cada tipo
de materia prima empleada en la confección de los productos
comprendidos en esta norma y se deberán repetir cada vez que se cambie
las materias primas especificadas en el proceso de fabricación.
3.2. Los productos terminados deberán ser sometidos a los siguientes
ensayos: IRRITACION PRIMARIA, IRRITACION ACUMULATIVA Y SENSIBILIZACION.
Estos ensayos se repetirán toda vez que cambie el proceso de
fabricación, y se encuentran descriptos en el anexo 3 de esta norma.
4. Control de Fabricación
4.1. Las empresas fabricantes deberán estar debidamente habilitadas
para funcionar por la autoridad competente, adoptando las "Buenas
Prácticas de Fabricación" preconizadas por la Organización Mundial de
la Salud.
4.2. Todas las materias primas y los productos terminados deberán ser
analizados de acuerdo con métodos capaces de verificar su inocuidad y
sometidas a la evaluación microbiológica de orientación, con
periodicidad variable, y de acuerdo con la naturaleza de cada material.
4.2.1. La evaluación microbiológica, deberá responder a los siguientes
límites de aceptabilidad para una muestra de 5 g: Ausencia de
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y
Clostridium sp. o clostridios sulfito-reductores.
La cantidad de
gérmenes aeróbicos mesófilos, no debe pasar de 1000 unidades formadoras
de colonias (U.F.C.) por gramo de muestra.
4.2.2. En todos los casos se emplearán métodos de análisis de
reconocida validez descriptos en el anexo III de esta norma.
4.2.3. Los ensayos deberán ser realizados en laboratorios de la propia
empresa o en aquellos que estén sujetos al control de la autoridad
competente.
4.3. Cada lote de producto deberá ser identificado mediante
codificación impresa en el respectivo rótulo, que viabilice localizar y
revisar en los libros de registros, todas las operaciones de
fabricación e inspección practicadas durante los respectivos ciclos de
producción.
4.3.1. Los rótulos deberán contener la marca del producto, el nombre de
la empresa productora o fraccionadora, el nombre del responsable
técnico y el número de registro.
4.4. Los documentos en que estén registrados los resultados de los
ensayos de control de fabricación, aludidos en el ítem 4.2. deberán ser
archivados en la empresa productora, por un período de cinco años, para
permitir en cualquier momento la acción de la Fiscalización Sanitaria.
5. Almacenamiento
5.1. Los productos absorbentes descartables que se tratan en esta
norma, deberán ser almacenados en local seco y limpio, libre de
roedores e insectos.
ANEXO 2
PRODUCTOS ABSORBENTES DESCARTABLES DE USO INTRAVAGINAL
1. Definición
1.1. Son considerados productos absorbentes descartables de uso
intravaginal; los artículos destinados a absorber o retener excreciones
y secreciones menstruales e intermenstruales aplicados por inserción
vaginal.
2. Composición
2.1. Los productos que se trata en esta norma deberán ser compuestos de
fibras de algodón hidrófilo y/u otros materiales absorbentes que no
contengan ingredientes farmacológicamente activos.
3. Requisitos de Calidad
3.1. Las materias primas presentes en la composición de los productos
deberán ser de naturaleza atóxica, para confirmación de la cual, serán
sometidas obligatoriamente a los siguientes ensayos preclínicos:
Citotoxicidad, irritación primaria y sensibilización. Estos ensayos se
efectuarán para cada tipo de materia prima empleada en la confección de
los productos comprendidos en esta norma y se deberán repetir cada vez
que se cambien las materias primas especificadas en el proceso de
fabricación.
3.2. Los productos terminados deberán ser sometidos a los siguientes
ensayos preclínicos: Irritación primaria, irritación acumulativa y
sensibilización. Estos ensayos se repetirán cada vez que se cambie el
proceso de fabricación.
4. Control de fabricación
4.1. Todas las materias primas componentes de los productos, deberán
ser analizadas con métodos capaces de verificar su inocuidad y
sometidas a una evaluación microbiológica de orientación, con
periodicidad variable, de acuerdo con la naturaleza de cada material.
4.2. Los productos terminados también deberán ser analizados a través
de métodos capaces de verificar su inocuidad.
4.2.1. El recuento de gérmenes deberá ser inferior a 1000
microorganismos por unidad elaborada. Garantizada esa condición, el
ensayo microbiológico posterior, deberá demostrar ausencia de:
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa y
microorganismos anaeróbicos. Cuando el recuento microbiano se encuentra
entre 500 y 1000 U.F.C. por unidad de producto, se deberá proceder a la
inmediata revisación en las condiciones de operación de fabricación.
4.2.2. Los ensayos de irritación primaria dérmica, irritación
acumulativa y el de sensibilización, se realizarán de acuerdo con las
técnicas descriptas del Anexo III de esta norma.
4.2.3. Los ensayos deberán ser realizados en Laboratorios de la empresa
o en aquellos que estén sujetos al control de la Autoridad competente.
4.3. Las empresas que intervengan en la elaboración o fraccionamiento
de productos comprendidos en esta norma, deberán ser habilitadas por
Autoridad competente, con la Dirección Técnica de un Profesional
Farmacéutico.
4.3.1. Los establecimientos, sus equipamientos e instalaciones
dedicadas a las actividades enunciadas en el ítem anterior, así como
los procesos de fabricación y de control químico-microbiológico,
deberán responder a las "buenas prácticas de fabricación", enunciadas
por la Organización Mundial de la Salud.
4.3.2. El área y los equipamientos donde se realiza la fabricación de
estos productos, deberán ser de uso exclusivo para dicha elaboración.
4.4. Los embalajes de los productos contemplados en esta norma, deberán
reunir condiciones que impidan su contaminación.
4.4.1. Los rótulos deberán especificar la marca del producto, el nombre
del establecimiento productor o fraccionador, nombre del responsable
técnico y número de registro.
4.5. Cada lote del producto deberá ser identificado mediante
codificación impresa en el respectivo rótulo que viabilice localizar y
revisar en los libros de registros, todas las operaciones de
fabricación e inspección practicadas durante los respectivos ciclos de
producción.
4.6. Los documentos en que están registrados los resultados de los
ensayos de control de fabricación aludidos, en los ítem 4.1 y 4.2,
deberán ser archivados en la empresa productora por un período de cinco
años, para permitir en cualquier momento, la acción de la fiscalización
sanitaria.
5. Almacenamiento
5.1. Los productos absorbentes descartables de que trata esta norma
deberán ser almacenados en local seco y limpio, libre de roedores e
insectos.
ANEXO 3
ENSAYOS PRECLÍNICOS PARA PRODUCTOS DESCARTABLES DE USO EXTERNO Y DE USO
INTRAVAGINAL
1. IRRITACIÓN CUTÁNEA PRIMARIA
1.1.
Objetivo
La presente técnica evalúa el potencial de irritación
cutánea, después de una única aplicación de la sustancia a ser ensayada.
1.2. Materiales y Métodos.
1.2.1. Equipamiento.
- Estufa.
- Erlen-Meyers.
- Pipetas de 1,0 ml.
- Rasurador.
- Jeringa de 1,0 ml.
- Espátula.
- Balanza analítica.
- Aguja de inyección estéril.
- Gasa estéril.
- Cinta adhesiva hipoalérgica.
- Calibre.
- Esparadrapo.
- Lente de aumento.
1.2.2.
Soluciones.
- Solución isotónica de cloruro de sodio estéril.
- Agua destilada estéril.
1.2.3.
Animales.
- 6 (seis) conejos albinos, machos o hembras, de peso corpóreo de 2 a 3
Kg.
Los animales deben ser mantenidos en jaulas individuales en todo el
período de la prueba, en sala de temperatura constante (22 +/- 3ºC) y
de humedad relativa entre 30 a 70%.
1.2.4.
Selección de animales.
1.2.4.1. Los animales que presentan reacción positiva en una prueba
anterior de irritación cutánea, deberán ser excluidos de este ensayo
(ver criterio para reacción positiva ítem 1.2.10.2).
1.2.4.2. Los animales que hayan presentado reacción negativa en una
prueba previa de irritación cutánea, sólo podrán ser utilizados luego
de un período de descanso de por lo menos una semana (ver ítem
1.2.10.2) para la validez de esta reutilización.
1.2.4.3. Después de rasurar los animales, observar si la piel de los
mismos se encuentra íntegra, esto es, sin ninguna lesión. Rechazar los
animales que presenten problemas en la piel. Controlar el peso corporal
de los animales al inicio y al final de la prueba.
OBSERVACION
Los animales que fueron usados para la prueba con
sustancias que alteran el color de la piel no deben ser usados para la
prueba de irritación cutánea.
1.2.5. Preparación de los animales. Rasurar cuidadosamente cada animal
en 4 (cuatro) áreas, de 2,5 cm2 c/u.
Hacer 2 (dos) escoriaciones
paralelas con una aguja de inyección esterilizada, evitándose el
sangrado. Las áreas rasuradas superior e inferior del lado derecho del
animal (áreas 2 y 4 de la figura I).
Las áreas rasuradas superior e
inferior del lado izquierdo del animal deberán permanecer intactas
(áreas 1 y 3 de la figura I).
1.2.6.
Preparación de la
muestra.
Las muestras a aplicar deben tener
una superficie de 2,5 cm2 y ser previamente humedecidas a saturación
con solución fisiológica estéril.
1.2.7.
Aplicación del
producto.
Asegurar al animal delicadamente hasta
que se calme.
Aplicar el producto sobre las 2 áreas rasuradas
superiores (áreas 1 y 2 de la Figura I), en cuanto a las 2 áreas
inferiores (áreas 3 y 4 de Figura I) servirán como control.
1.2.8.
Colocación del
"parche" oclusivo.
Después de la aplicación del
producto, cubrir cada una de las 4 (cuatro) áreas rasuradas con una
gasa estéril de 2,5 cm2 cada una, la cual debe ser fijada a los pelos
del animal con cinta adhesiva hipoalergénica o esparadrapo.
Todas las
áreas rasuradas deben ser conjuntamente cubiertas con una gasa estéril,
la cual debe ser envuelta alrededor del animal y fijada con cinta
adhesiva hipoalérgica.
1.2.9.
Lectura de las
reacciones cutáneas:
Las reacciones cutáneas
deben ser analizadas 24 y 72 horas después de la aplicación del
producto.
Retirar el parche oclusivo 24 hs. después de la aplicación
del producto y efectuar la lectura.
Las áreas controles tienen como
única finalidad, facilitar una comparación con las áreas ensayadas.
La
evaluación de formación de edema, debe ser medida a través de un
calibre y el cálculo del valor del edema se hace a través de la fórmula:
Donde
Lat = Lectura del área de prueba (íntegra y escoriada).
Lac = Lectura del área control (íntegra y escoriada).
Ed mm = Valor del edema en milímetros.
La graduación de la intensidad de las reacciones cutáneas está basada
en el método de Draize (1,2).
OBSERVACIONES
La lectura de las reacciones cutáneas que alteran el color de la piel.
En el caso de productos colorantes que alteran el color de la piel,
dificultando la visualización de Eritema, la evaluación se hace de la
siguiente forma:
1) En la lectura de 24 hs se hace la biopsia de las áreas aplicadas en
3 (tres) animales.
En el mismo sentido hecho para los 3 (tres) animales
restantes en la lectura de 72 hs.
2) Se efectúa el examen macro y microscópico de las biopsias (Método de
coloración HE y Van Gienson).
3) Una graduación microscópica de las reacciones cutáneas se encuentra
descripta en la tabla II.
GRADUACION DE REACCIONES
CUTANEAS
TABLA 1
I.1. Formación de eritema.
Grado 0 - Piel Normal:
Generalmente de color blanca, pudiéndose presentar coloración rosada.
Grado 1 - Eritema leve:
La piel se presenta enrojecida pudiendo estar localizada en toda el
área.
Grado 2 - Eritema moderado:
La piel se presenta roja, generalmente en toda el área.
Grado 3 - Eritema definido:
La piel se presenta con enrojecimiento intenso y difuso, en toda el
área.
Grado 4 - Eritema severo:
La piel se presenta roja oscura, con leve formación de escaras (daño en
profundidad).
I.2. Formación de edema.
- Grado 0 - Ningún edema:
El valor del Edema (Ed mm) es igual a 0 (cero).
- Grado I - Edema leve:
El valor del Edema (Ed mm) debe estar comprendido entre 0,25 mm y 0,49
mm.
- Grado 2 - Edema moderado
(área con bordes bien definidos con edema
perceptible): El valor del Edema (Ed mm) debe estar comprendido entre
0,5 mm y 0,74 mm.
- Grado 3 - Edema definido:
El valor del Edema (Ed mm) debe estar comprendido entre 0,75 mm y 1 mm.
- Grado 4 - Edema severo:
El valor del Edema (Ed mm) es mayor de 1 mm pudiendo a veces ser mayor
que el área de exposición.
Tabla 2:
Graduación microscópica de las alteraciones cutáneas determinadas por
productos que alteran el color de la piel.
II.1. Congestión.
- Grado 0 - Normal.
Los vasos del tejido cutáneo aparecen normales.
- Grado 1 - Discreta.
Los vasos se muestran ligeramente turgentes en correspondencia con el
aumento de flujo sanguíneo.
- Grado 2 - Intensa.
Excesivo flujo de sangre en los vasos.
II.2. Inflamación.
- Grado 0 - Normal.
No se percibe infiltración inflamatoria en los diversos planos del
tejido cutáneo.
- Grado 1 - Discreto.
La infiltración inflamatoria se caracteriza por
un pequeño número de células inflamatorias (polimorfonucleares y/o
mononucleares), dispersas, pudiendo ser observadas o no en los
diferentes planos del tejido cutáneo.
- Grado 2 - Moderado.
El infiltrado inflamatorio evidente
(polimorfononucleares y/o mononucleares) podrá o no ser observado en
varios planos de la piel.
- Grado 3 - Intensa.
En este caso el número de células inflamatorias es
de tal magnitud que a veces perjudica la visualización de las
estructuras de la piel.
II.3. Edema.
- Grado 0 - Normal.
No se presenta líquido en los espacios intersticiales.
- Grado 1 - Presencia.
Acumulación de líquido en los espacios intersticiales.
1.2.10. Resultados.
1.2.10.1. Cálculo del índice de irritación primaria.
- Cálculo del índice de irritación primaria para productos que no
alteran el color de la piel.
- Obtener una media aritmética de las siguientes observaciones:
Edema de piel íntegra 24 hs.
Edema de piel escoriada 24 hs.
Eritema de piel íntegra 24 hs.
Eritema de piel escoriada 24 hs.
Edema de piel íntegra 72 hs.
Edema de piel escoriada 72 hs.
Eritema de piel íntegra 72 hs.
Eritema de piel escoriada 72 hs.
- Obtener las sumatorias de esta 8 (ocho) medias aritméticas y
dividirlas por 4 (cuatro). El valor encontrado es el índice de
irritación primaria cutánea del producto.
- Cálculo del índice de irritación primaria cutánea para productos que
alteran el color de la piel.
- Congestión en la piel íntegra y escoriada de los 3 (tres) animales en
24 hs.
- Inflamación en la piel íntegra y escoriada de los 3 (tres) animales
en 24 hs.
- Edema en la piel íntegra y escoriada de los 3 (tres) animales en 24
hs.
- Congestión en la piel íntegra y escoriada de los 3 (tres) animales en
72 hs.
- Inflamación en piel íntegra y escoriada de los 3 (tres) animales en
72 hs.
- Edema en piel íntegra y escoriada de los 3 (tres) animales en 72 hs.
Obtener la sumatoria de las 6 (seis) medias aritméticas y dividirlas
por 3.
El valor encontrado es el índice de irritación cutánea primaria del
producto.
1.2.10.2. Clasificación de irritante cutáneo primario.
Clasificación de irritante primario cutáneo para productos que no
alteran el color de la piel.
De acuerdo con el índice de irritación
cutánea primaria obtenido, el producto puede ser clasificado en:
Clasificación de irritante cutáneo primario para productos que alteran
el color de la piel.
De acuerdo con el índice de irritación primaria obtenido el producto
puede ser clasificado en:
Observaciones:
En el caso que de pruebas realizadas con animales que
fueron utilizados anteriormente en pruebas de irritación cutánea, no
será válido el resultado positivo (producida irritante), debiendo ser
repetida la prueba.
Criterio de animal positivo
El animal será considerado positivo cuando presente una o mas
reacciones positivas citadas mas adelante en cualquier período de
prueba.
Las reacciones cutáneas son clasificadas dentro de un criterio positivo
o negativo según:
1.2.10.3. Criterio de producto satisfactorio.
- Productos que no alteran el color de la piel.
- Un producto probado es considerado como satisfactorio si su índice de
irritación cutánea estuviera comprendido entre 0 (cero) y 0.9.
- Productos que alteran el color de la piel.
- Un producto testado es considerado como satisfactorio si su índice de
irritación cutánea estuviera comprendido entre 0 (cero) y 0.59.
1.2.10.4. Duración de la prueba 5 días.
1.2.10.5. Referencias Bibliográficas.
1) Draize J.H. (1965) Dermal Toxicity Appraisal of the Safe Chemicals
in Foods, Drugs and Cosmetics.pp. 46-59, The Association of Food and
Drug Officials of the United States, Topeka, Kansas.
2) Draize, J.H., Woodard, G., Calvery, H.O. (1944). Methods for the
study of irritation and toxicity of substances applied topically to the
skin and mucous membranes. J. Pharmacol. Exp. Ther. 83, 377-390.
2. IRRITACIÓN CUTÁNEA ACUMULATIVA
2.1. Objetivo. La presente técnica presenta un análisis del potencial
de irritación cutánea después de la aplicación repetida de la sustancia
a ser ensayada.
2.2. Material y Métodos.
2.2.1. Equipamientos: Seguir como lo descripto en el ítem 1.2.1. para
el ensayo de "irritación primaria cutánea".
2.2.2. Soluciones: Seguir como lo descripto en el ítem 1.2.2. para el
ensayo de "irritación primaria cutánea".
2.2.3. Animales: Seguir como lo descripto en el ítem 1.2.3. para ensayo
de "irritación primaria cutánea".
2.2.4. Selección de los animales: Seguir como lo descripto en el ítem
1.2.4. para el ensayo de "irritación primaria cutánea".
2.2.5. Preparación de los animales: Seguir como lo descripto en el ítem
1.2.5. para el ensayo de "irritación primaria cutánea".
2.2.6. Preparación de la muestra: Seguir como lo descripto en el ítem
1.2.6. para el ensayo de "irritación primaria cutánea".
2.2.7. Aplicación del producto: Seguir con lo descripto en el ítem
1.1.7. del ensayo de irritación primaria cutánea. Aplicar el producto
sobre las dos áreas peladas previamente (áreas 1 y 2 - fig. 1) en tanto
que las 2 áreas inferiores (áreas 3 y 4 - fig. 1) servirán como
controles. La aplicación del producto debería ser hecha durante 10 días
consecutivos. Durante ese período el escarificado de las áreas peladas
debe ser alternado y el rasurado de los animales debe ser hecho todos
los viernes.
2.2.8. Colocación del parche "oclusivo". Seguir conforme a lo descripto
en el ítem 1.2.8. para "Irritación primaria cutánea" para cada día de
aplicación.
2.2.9. Lectura y graduación de las reacciones cutáneas. Las lecturas
deberán ser hechas 24 a 72 hs. después de la última aplicación
siguiendo las tablas de graduación de las lesiones descriptas en los
ítem 1.2.9. y 1.2.10. para "Irritación primaria cutánea".
2.3. Bibliografía.
- Draize J.H. Dermal Toxicity Food Drug Cosmetic Law Journal 10:
722-(1955).
- Somers, G.F. Testing drugs for Dermal Toxicity, J. Soc. Cosmetic
Chemists 15: 385-404- (1964).
- Protocolo de irritacao primaria cutánea. Departamento de Farmacología
e Toxicología - INCQSIFIOCRUZ.
- Protocolo de Irritación Primaria cutánea. Departamento de
Farmacología del INFYB.
3. SENSIBILIZACIÓN POR APLICACIÓN TÓPICA
Estudio preliminar: Este test no debe ser realizado si existen
alteraciones de la piel en el test de Irritación Primaria Dérmica.
3.1. Objetivo. La presente técnica evalúa el potencial de
sensibilización de los materiales en estudio.
3.2. Materiales y reactivos.
3.2.1. Materiales.
Parches de 6 cm2 de las materias primas a utilizar y del producto
terminado en el ensayo, embebidos en solución fisiológica a saturación.
- Solución Fisiológica Estéril.
- Vehículo oleoso: Adyuvante completo de Freund (F.C.A.).
- Agujas hipodérmicas.
- Gasa estéril.
- Plástico adhesivo impermeable.
- Cinta adhesiva Hipoalergénica.
- Esparadrapo.
3.2.2. Soluciones.
- Solución isotónica de cloruro de sodio estéril.
- Adyuvante de Freund completo diluido al 50% con Solución isotónica de
Cloruro de Sodio estéril y homogeneizado.
3.2.3. Animales 20 cobayas albinos (10 hembras y 10 machos, peso al
comienzo de la experiencia 300-400 grs). La mitad de los cuales serán
destinados a control.
3.3. Ejecución del ensayo.
3.3.1. Fase de inducción.
3.3.1.1. Preparación de la solución a inyectar al grupo tratado y al
grupo control: 0,1 ml de adyuvante de Freund completo (F.C.A.) diluido
al 50% solución salina isotónica estéril.
3.3.1.2. Rasurar la región dorsal de los cobayos en una superficie de
alrededor de 9 cm2.
3.3.1.3. Aplicación tópica de la sustancia usando los parches oclusivos
y dos inyecciones intradérmicas del adyuvante de Freund completo
diluido.
Para el grupo control se realiza el mismo procedimiento, pero
en lugar de aplicar la materia prima embebida en solución fisiológica
estéril, se aplicará en 10 animales gasa embebida en solución
fisiológica estéril.
El día lunes de cada semana se rasura la región a
tratar, el día 1 y 10 los cobayos reciben una inyección intradérmica de
adyuvante de Freund completo diluido, los dos sitios de la inyección
deben estar tan cerca como sea posible del área aplicada.
La sustancia
de prueba se aplica tres veces por semana con 2 días de intervalo
durante 3 semanas y una al comienzo de la 4ta. semana.
El sitio de
aplicación debe ser justo encima del sitio de inyección.
El parche se
retira cada 48 hs.
El último parche (décimo) se retira el día 24, luego
de 48 hs de contacto con la piel.
3.3.1.4. Suspensión del tratamiento.
El tratamiento es suspendido desde
el día 24 al 35 inclusive (por un período de 12 días). Este es el
tiempo necesario para que el organismo produzca la respuesta
inmunológica.
3.3.2. Fase desencadenante.
El día 36 los cobayos son rasurados, en la
región del abdomen (flanco izquierdo): Sin tratamiento previo, se
coloca un parche oclusivo con la sustancia de prueba y se deja durante
48 hs. El día 38 se retira.
3.4. Evaluación.
Las lecturas se realizan en el sitio desencadenante a
las 1, 6, 24 y 48 hs. luego de retirado el parche oclusivo, de acuerdo
con la escala descripta en el ensayo de irritación dérmica primaria.
Debe realizarse examen histológico de la piel cuando denota una lesión
en forma macroscópica o cuando la reacción sea dudosa.
3.4.1. Expresión de resultados.
El examen macroscópico e histológico
debe ser realizado en forma ciega.
El resultado es positivo cuando uno
o más animales muestran una reacción macroscópica confirmada
histológicamente como reacción de sensibilización.
El resultado es
negativo cuando ningún animal muestra evidencia de reacción
macroscópica.
El resultado es dudoso cuando hay evidencia de reacción
macroscópica no confirmada histológicamente. Los absorbentes
descartables y sus materiales constitutivos deben dar negativo el test
de sensibilización.
3.5. Referencia bibliográfica. Método de Magnussen y Kligman modificado
según J. M. Faccini y J. P. Guillot. Animals and alteratives in
toxicity Academic Press 1983.
4. ENSAYO DE CITOTOXICIDAD IN VITRO
4.1. Instrumental y reactivos.
a) Estufa a 37º C.
b) Cámara Húmeda conteniendo CO2 al 5%.
c) Microscopio con Faz invertida.
d) Célula ATCC, CCLI, NCTC y CLON 929 de Fibroblastos de ratón u otras
líneas celulares sensibles al ensayo.
e) Agar.
f) Colorante vital: Rojo neutro.
g) Medio de cultivo: EAGLE (M.E.M.), ph = 7.3.
h) Frasco de cultivo de plástico neutro de 25 cm2.
i) Placas de Petri.
j) Pipetas.
k) P.B.S. -Solución Tampón de Fosfato (ph = Neutro).
l) Pinza estéril.
4.2. Tamaño de la muestra
1 cm2 ó 100 mg. de peso.
4.2.1 Ejecución del ensayo
Colocar el cultivo de células en cámara húmeda con CO, al 5 %.
inoculando 5 ml de una suspensión celular, con una concentración de 130
x 10 ml. en medio EAGLE e incubar a 37º C por 48 horas.
4.2.2. Descartar el medio, con pipeta estéril y en seguida lavar con
Solución Tampón de Fosfato+.
4.2.3. Adicionar 4 ml de Agar precalentado en placa de Petri con
colorante vital.
4.2.4. Colocar la muestra con pinza estéril sobre la zona central, de
la placa e incubar nuevamente a 37º C.
4.2.5. Retirar la muestra, después de 24 hs. y anotar o marcar, el área
de inhibición.
4.2.6. Observar el microscopio de Faz invertida.
4.2.7. Resultados: Observar el índice de Zona (I. Z.), o sea el área no
coloreada, y el índice de Lisis (I. L.) que indica el porcentaje de
células degeneradas.
Ambos índices, nos dan el índice de respuesta (I. R.) conforme a la
siguiente relación:
IR = IZ/IL
Tabla 8. Índice de Zona/Lisis
4.3. El material en ensayo no debe presentar resultados distintos a los
controles negativos.
5. CONTROL MICROBIOLÓGICO
5.1. Introducción.
Las presentes técnicas microbiológicas tienen como
objeto determinar los números de los microorganismos aerobios viales
presentes en las muestras (bacterias, hongos y levaduras) así como
también la ausencia o presencia de determinados géneros y especies
bacterianos.
5.2. Capacidad nutritiva de los medios de cultivo:
Preparar cultivos en
Caldo Caseína Soja de los siguientes microorganismos: Staphylococus
Aureus ATCC 6538P o 6538; Bacilus subtilis ATCC 6633; Escherichia coli
ATCC 8739; Candida albicans ATCC 10331 o 3001. Incubar los tres
primeros durante 18 - 24 Hs. a 30 - 35º C y el de Candida albicans
durante 48 hs. a 20 - 25º C. Diluir cada cultivo en buffer fosfato pH
7,2 de modo de obtener 100 cél/ml. y emplear el inóculo de los
microorganismos separadamente como control de los medios de cultivo
utilizados.
5.3. Materiales y equipos.
1. Pipetas graduadas, estériles de 1 ml; 2ml; 10 ml; y 20 ml.
2. Erlenmeyers. Balones de Vidrio y Vasos de Precipitados estériles.
3. Placas de Petri de 20 x 100 mm estériles.
4. Varillas de Vidrio estériles.
5. Tubos de Ensayos de 20 x 200 mm estériles.
6. Paños de Gasa Estériles.
7. Instrumentos, pinzas, tijeras, bisturíes, hojas de bisturí,
espátulas, estériles.
8. Balanza con Sensibilidad 0,01 g.
9. Estufas de Incubación reguladas a 20º C, 25º C y a 30º C.
10. Sobres generadores de atmósfera anaeróbica, indicadores y jarras
para anaerobiosis.
11. Sistema de vela para microaerofilia o sobres generadores de
atmósfera microaerófila.
5.3.5.4. Medios de cultivo y soluciones:
1. Caldo Sabouraud Dextrosa.
2. Caldo Caseína Soja.
3. Caldo Lactosado.
4. Caldo Tioglicolato 135º C (Tratado durante 10 min. en baño de agua a
100º C y enfriado inmediatamente). Puede ser reemplazado por Caldo
Cerebro-Corazón Prereducido o Por Caldo Carne Cocida.
5. Agar Papa Dextrosa o Agar Sabouraud Dextrosa.
6. Agar Sulfito Polimixina Sulfadiazina (Agar S.P.S.) de Angelotti.
7. Agar MacConkey.
8. Agar Manitol Salado o Agar Vogel-Johnson o Agar Baird Parker.
9. Agar Cetrimida.
10. Agar Caseína Soja.
11. Medios de Cultivo para Pruebas Bioquímicas de Identificación de S.
aureus: E. Coli; P. aeruginosa.
12. Buffer Fosfato pH 7,2.
5.5. Reactivos:
1. Tween 80.
2. Alcohol Etílico 70º.
3. Plasma de Conejo.
4. Colorante para Gram.
5. Reactivos para revelar las pruebas bioquímicas.
6. Solución de Clorhidrato de N-N-N-N Tetrametil p-Fenilen Diamina al
0,5% para prueba de oxidasa.
7. Parafina estéril.
5.6. Manipulación de la muestra: Seguir las siguientes recomendaciones:
1. Analizar las muestras lo más pronto posible luego de su llegada al
laboratorio. Si fuese necesario almacenarlas; hacerlo a temperatura
ambiente.
2. Inspeccionarlas cuidadosamente antes de abrirlas verificando las
irregularidades de sus envases.
3. Desinfectar cada paquete individual de muestra con una gasa estéril
embebida en un desinfectante que no ataque el material de empaque.
4. Para cada análisis microbiológico, es preciso utilizar una porción
representativa del contenido de la muestra, usar una porción de 10 g.
5. Si no hubiere necesidad de análisis múltiples, estudio microbiano,
toxicología y química, la submuestra para el examen microbiológico
deberá ser retirada en primer lugar.
5.7. Preparación de la muestra:
En la preparación de la muestra a ser
probada, no deberá producirse alteración del número o tipo de
microorganismos originalmente presentes.
La muestra deberá ser removida
asépticamente, pesando 10 g. en un vaso de precipitados estéril, para
cada una de las pruebas descriptas.
Se puede utilizar un pequeño
volumen de un agente emulsificante estéril, como dos polisorbatos 80 en
la preparación de la suspensión.
5.8.1. Método de recuento en placa:
Diluir la suspensión de modo de
obtener un recuento entre 30 a 300 colonias. Pipetear 1 ml. de cada
dilución en placas de Petri en duplicado. Agregar 15 a 20 ml de agar
caseína soja previamente fundido y enfriado a aproximadamente a 40º C.
Mezclar la muestra con el medio de cultivo con movimientos rotatorios.
Dejar solidificar el contenido a temperatura ambiente e incubar a
30-35º durante 48 a 72 hs.
Si no se observan colonias microbianas en las placas de la dilución
1:10 en adelante, expresar los resultados como: "menos de 10 U.F.C./g
de muestra".
5.9. Prueba para Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa.
Agregar a la muestra caldo de caseína soja hasta completar 100 ml.
Incubar a 30-35º de 24 a 48 hs. Si hubiera evidencia de crecimiento,
sembrar con ansa en una placa de agar Vogel Johnson y en una placa de
agar Cetrimida. Incubar las placas de 30-35º C durante 24 a 48 hs. Si
al cabo del período de incubación no se observaran colonias sospechosas
de Staphylococcus aureus la muestra satisface las exigencias de
ausencias de estos microorganismos.
Cuadro II. Características morfológicas de Staphyloccocus aureus en
medios selectivos.
5.9.1. Prueba de la coagulasa (para Staphylococcus aureus).
Inocular pequeñas cantidades de crecimiento en agar inclinado en 0,2 ml
de caldo BHI. Incubar por 18 a 24 hs, a 35 + 2º C. Agregar 0,5 ml, de
coagulasa plasmática de conejo reconstituida (com EDTA) y homogeneizar.
Incubar a 35º + 2º C y observar.
Las cepas que producen coagulasa francamente, pueden requerir una noche
de incubación para que la formación del coágulo se torne evidente.
Deberán utilizarse controles negativos y positivos. Si no fuera
observado ningún grado de coagulación, la muestra satisface las
exigencias de las pruebas para ausencia de Staphlococcus aureus.
Cuadro III. Características morfológicas - Pseudomonas auruginosas.
5.9.2. Prueba de oxidasa y de pigmentos para Pseudomonas aeroginosas.
A
partir del agar cetrimida sembrar con anzar en los medios para detectar
Fluoresceina y Piocanina. Incubar a 35 + 2º C por un período de tiempo
no inferior a 3 días. Examinar las estrías de crecimiento a la luz U.V.
Observando las características descriptas en el Cuadro III. Hacer la
prueba de oxidasa con el crecimiento sospechoso. Si la prueba fuese
negativa la muestra satisface las exigencias para ausencia de
Pseudomonas aeruginosa.
Si es necesario para las cepas de Pseudomonas aeruginosa
apiocianogénicas, serán necesarias otras pruebas para su identificación.
5.10. Prueba para Escherichia coli.
Agregar a la muestra, caldo
lactosado, de modo de obtener un volumen final de 100 ml. Incubar a
30-35º C durante 24 a 48 hs.
Si hubiera evidencia de crecimiento,
inocular una placa de agar MacConKey. Incubar a 30-35º C durante 24 a
48 hs. Si se observa desarrollo de colonias sospechosas de Escherichia
coli, sembrar una placa con agar Levine (Eosina - Azul de Metileno). Si
no aparecen colonias con brillo metálico característico o color negro
azulado la muestra satisface las exigencias para ausencia de
Escherichia coli. Su presencia podrá ser confirmada por pruebas
bioquímicas adicionales.
5.11. Investigación de clostridios.
Transferir 50 ml. de preparación de
muestra para 90 ml de caldo tioglicolato 135º C o caldo BHI con
extracto de levaduras prereducido o caldo carne cocida. Incubar a
30-35º C durante 48 hs. en ambiente anaerobio (excepto el BHI
prereducido). A partir de los caldos en que se observase crecimiento
sembrar en placas de agar para anaerobios, incubar a 35º C durante 48
hs. en ambiente anaerobio. Aislar las colonias sospechosas en tubos con
BHI prereducido o con los otros caldos. Incubar de la misma forma que
antes. En los caldos que hubiera crecimiento llevar a cabo las
siguientes pruebas:
1. Coloración de gram (bacilos gram positivos con morfología compatible
con el género Clostridium).
2. Tipo respiratorio.
3. Termo resistencia.
El tipo respiratorio se determina sembrando el crecimiento de cada tubo
en 3 placas conteniendo agar para anaerobios.
Incubar una placa en anaerobiosis en las condiciones ya descriptas.
Otra placa en microaerofilia y la restante en aerobiosis en las
condiciones de temperatura y tiempo ya descriptas.
Se probará la termo resistencia sembrando 0.1 del crecimiento en los
tubos de BHI prereducido o caldo tioglicolato 135 C caldo carne cocida
y calentando a 80º C durante 15 min.
En seguida incubarlos en las condiciones ya descriptas. Paralelamente,
incubar un control positivo no sometido a la prueba de resistencia.
Al cabo del período de incubación, observar el crecimiento de cada
placa incubada a las diferentes condiciones y determinar o no presencia
de microorganismos anaerobios en el producto. Si es positivo proceder a
la coloración de gram y a la prueba de catalasa. Hacer lo mismo con los
tubos sometidos a la prueba de termo resistencia. si hubiera evidencia
de crecimiento, investigar la presencia de esporos por el método de
coloración de Gram.
5.12. Investigación de clostridium sulfito reductores en 5 g de muestra.
Se siembran 5 ml de la dilución 1:10 de la muestra en 50 ml de caldo
tioglicolato doble concentración adicionado de N3Na 0,02%, previamente
calentando a 100º C durante 10 min. y enfriado. Se cubre con parafina
estéril y se incuba durante 48 hs. a 35º C. Se colocan porciones de 0,1
ml de este cultivo en tubos estériles. Luego se cubre con Agar fundido
y enfriado a 40º C. Se cubre con parafina y se incuba durante no menos
de 3 días a 37º C. El desarrollo de colonias negras indica que la
prueba es positiva.
Referencias bibliográficas.
1. Microbiological Test-Microbial Limit Tests -USP XXI.
2. Manual Análisis Microbiológicas de Cosméticos de
INCOS-fiocruz-Aerosol o Cosméticos -Jan/Fav 89.
3. Farmacopeia Brasileira - 4ta. ed.