MINISTERIO DE AGRICULTURA, GANADERIA Y PESCA

INSTITUTO NACIONAL DE VITIVINICULTURA

Resolución Nº C. 2/2014

Mendoza, 17/2/2014

VISTO el Expediente Nº S093:0012042/2013 del Registro del INSTITUTO NACIONAL DE VITIVINICULTURA, la Ley General de Vinos Nº 14.878, la Resolución Nº C.24 de fecha 19 de agosto de 2003, y

CONSIDERANDO:

Que por el citado expediente se tramita la oficialización del método y validación de determinación de relaciones isotópicas del oxígeno en el agua de los vinos por espectrometría de masas.

Que los resultados del método oficial establecido por la Resolución Nº C.24 de fecha 19 de agosto de 2003, no presentan diferencias significativas con el método propuesto, adecuándose a la modernización instrumental.

Que dicha determinación posibilita el control de la autenticidad de vinos a través del valor de la relación isotópica de los isótopos estables del oxígeno 180/160, efectuada sobre el agua del vino, mediante un equipo Espectrómetro de Masas de Relaciones Isotópicas de Isótopos Estables (IRMS).

Que el factor responsable de dicha relación es el fraccionamiento isotópico que se produce en los procesos de asimilación y evapotranspiración del agua en la planta.

Que desde el año 1996 esta determinación es la base del Método Oficial de la OFICINA INTERNACIONAL DE LA VIÑA Y EL VINO (OIV) para establecer el origen del agua en los vinos.

Que la REPUBLICA ARGENTINA es país miembro de la O.I.V., representación ejercida por el INSTITUTO NACIONAL VITIVINICULTURA (INV), y ha participado en la aprobación de este método.

Que desde el momento de su aprobación, es un método aplicable en los estados miembros.

Que este método ha sido validado con la participación de Organismos de reconocido prestigio internacional.

Que el método, al utilizar el banco de datos de origen indudable de relaciones isotópicas, permite determinar si un vino ha sido adicionado de agua exógena y evaluar su grado de adición.

Que esta determinación tiene el respaldo científico suficiente para adoptarse como norma de control oficial por el INSTITUTO NACIONAL DE VITIVINICULTURA (INV).

Que Subgerencia de Asuntos Jurídicos de este Instituto ha tomado la intervención de su competencia.

Por ello, y en uso de las facultades conferidas por la Leyes Nros. 14.878 y 24.566 y el Decreto Nº 1.306/08,

EL PRESIDENTE DEL INSTITUTO NACIONAL DE VITIVINICULTURA

RESUELVE:

1° — Oficialízase el método de “DETERMINACION DE LA RELACION ISOTOPICA 180/160 DEL AGUA CONTENIDA EN LOS VINOS” que, junto a su VALIDACION, obran como ANEXO a la presente resolución.

2° — La adopción del presente método, entrará en vigencia a partir del día 5 de marzo de 2014.

3° — Derógase la Resolución Nº C.24 de fecha 19 de agosto de 2003 y toda otra norma que se oponga a la presente resolución.

4° — Regístrese, comuníquese, publíquese, dése a la Dirección Nacional del Registro Oficial para su publicación y cumplido, archívese. — C.P.N. GUILLERMO D. GARCIA, Presidente, Instituto Nacional de Vitivinicultura.



1. OBJETIVO DEL SISTEMA METODOLOGICO

El presente sistema permite a través del método y del banco de datos de origen indudable, determinar si un vino ha sido adicionado de agua exógena, por espectrometría de masas para relaciones de isótopos ¹⁸O/¹⁶O (IRMS).

2. PATRONES DE REFERENCIA

V-SMOW: Vienna-Standard Mean Ocean Water (¹⁸O/¹⁶O = RV-smow = 0,0020052)

GISP: Greenland Ice Sheet Precipitation.

SLAP: Standard Light Antarctic Precipitation.

Patrones de referencia secundarios: obtenidos de laboratorios acreditados

3. DEFINICIONES

¹⁸O/¹⁶O Relación de los isótopos 18 y 16 del oxígeno de una muestra concreta.


El patrón V-SMOW se toma como referencia para la escala relativa.

BCR: Oficina Comunitaria de Referencia

OIEA: Organismo Internacional de la Energía Atómica, con sede en Viena (Austria)

IMMR: Instituto de Medidas y Materiales de Referencia

IRMS: Espectrometría de masas para relaciones de isótopos (Isotope Ratio Mass Spectrometry)

m/z: Relación entre masa y carga

NIST: Instituto Estadounidense de Patrones y Tecnología (National Institute of Standards & Technology)

MR: Material de referencia.

4. FUNDAMENTO

La técnica que se describe a continuación está basada en el equilibrio isotópico que se establece en el agua presente en muestras de vino mediante un patrón de CO₂, según la siguiente reacción de intercambio isotópico:


Una vez alcanzado el equilibrio, el dióxido de carbono de la fase gaseosa se analiza mediante IRMS. La relación isotópica (18O/16O) se determina a partir del CO₂ que resulta de la reacción.

5. REACTIVOS Y MATERIALES

El instrumental y los materiales fungibles dependen del método elegido (véase el apartado 6). En los métodos usados normalmente se utiliza CO₂ para inducir el equilibrio en el agua del vino.

Pueden utilizarse los siguientes materiales de referencia, patrones internos y materiales fungibles:

5.1 Materiales de referencia


5.1.1 Dióxido de carbono como patrón secundario para la medición (Núm. CAS 00124-38-9).

5.1.2 Dióxido de carbono para el equilibrado (dependiendo del instrumento, este gas puede ser el mismo que en 5.1.1 o bien la mezcla de gases helio-dióxido de carbono, en el caso de los cilindros con sistema de flujo continuo).

5.1.3 Material de Referencia cuyo valor en escala ¹⁸O_V-SMOW emitido por laboratorio acreditado.

5.3 Materiales fungibles

Helio para análisis (Núm. CAS 07440-59-7)

6. INSTRUMENTAL

6.1 Espectrometría de masas para relaciones de isótopos (IRMS)

El espectrómetro de IRMS analiza el contenido de relaciones relativas en el CO₂ con una precisión interna del 0,060/00. Por precisión interna entendemos la diferencia entre dos medidas de una misma muestra de CO₂.

El espectrómetro de masas que se utiliza para determinar las relaciones isotópicas suele disponer de un detector triple, lo que permite medir simultáneamente tres corrientes distintas:

- m/z = 44 (¹²C¹⁶O¹⁶O)

- m/z = 45 (¹³C¹⁶O¹⁶O y ¹²C¹⁷O¹⁶O)

- m/z = 46 (¹²C¹⁶O¹⁸O, ¹²C¹⁷O¹⁷O y ¹³C¹⁷O¹⁶O)

Medidas las intensidades, la relación isotópica (18O/16O) se obtiene a partir de la intensidad de m/z = 46 y m/z = 44. Se realiza una corrección, pues hay que tener en cuenta la aportación de las especies moleculares ¹²C¹⁷O¹⁷O y ¹³C¹⁷O¹⁶O. Dicha aportación se calcula a partir del valor de la intensidad de m/z = 45 y las cantidades normales de los isótopos ¹³C y ¹⁷O que se dan en la naturaleza.

El espectrómetro deberá disponer de uno de los dos sistemas siguientes u otro sistema que asegure la introducción cuantitativa de la muestra:

- sistema de flujo continuo capaz de transferir cuantitativamente en el espectrómetro no sólo el CO₂ de los recipientes que contienen las muestras en equilibrio, sino también el patrón de CO₂.

- sistema de doble entrada para analizar alternativamente la muestra y un patrón de referencia.

6.2 Instrumental y material auxiliar (a modo de ejemplo)

Las características de todos los instrumentos y los materiales deben corresponder a las exigencias del método o del equipo utilizado (especificadas por el fabricante). No obstante, se pueden utilizar otros instrumentos o materiales que tengan las mismas prestaciones.

6.2.1 Frascos con septo adaptado al sistema empleado.

6.2.2 Pipetas aforadas, automáticas, tips.

6.2.3 Sistema de control de la temperatura para que la reacción de intercambio isotópico se lleve a cabo a una temperatura constante.

6.2.4 Bomba de vacío (si el sistema lo requiere).

6.2.5 Cambiador de muestras (si el sistema lo requiere).

6.2.6 Jeringuillas para las muestras (si el sistema lo requiere).

6.2.7 Columna de cromatografía de gases para separar el CO₂ de gases elementales (si el sistema lo requiere).

6.2.8 Sistema para extraer el agua (ej. cryo-trap o membranas permeables selectivas, si el sistema lo requiere).

7. PREPARACION DE LAS MUESTRAS

Las muestras de vinos y los materiales de referencia se utilizan para el análisis sin tratamiento previo.

A ser posible, los patrones usados para calibrar y para corregir las desviaciones deberán preferiblemente colocarse al inicio y al fin de cada serie e intercalarse cada diez muestras.

8. PROCEDIMIENTO

Determinar la relación isotópica ¹⁸O/¹⁶O induciendo el equilibrio en el agua con CO₂ y posterior análisis mediante IRMS. Los procedimientos pueden adaptarse en función de los cambios introducidos por los fabricantes del equipo o del instrumental, ya que existen varios tipos de sistemas de equilibrado, que implican varias maneras de operar. Pueden utilizarse dos procedimientos técnicos principales para la introducción de CO₂ en el IRMS, ya sea a través de un sistema de doble entrada o un sistema de flujo continuo. No es posible realizar la descripción de todos estos sistemas y de sus correspondientes maneras de operar, se describen algunos a modo de ejemplo.
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Nota: los volúmenes, temperaturas, presiones y tiempos se dan a título indicativo. Los valores adecuados deben buscarse en las especificaciones facilitadas por el fabricante o determinarse experimentalmente.

8.1 Equilibrio inducido automáticamente y con sistema de flujo continuo.

Con una pipeta, transferir una alícuota de la muestra o del patrón a un frasco. Disponer los frascos en una bandeja con control de temperatura. Con una jeringuilla de gases, introducir en los frascos una mezcla de He y CO₂. El CO₂ se queda en la parte superior de los frascos.

El equilibrio se alcanza transcurridas, como mínimo, 18 horas, normalmente a una temperatura constante.

Una vez finalizado el proceso, transferir el CO₂ obtenido al espectrómetro de masas mediante el sistema de flujo continuo. También se utiliza el flujo continuo para introducir el patrón de CO₂. La medida se efectúa según el manual del equipo.

8.2 Equilibrio inducido manualmente

Con una pipeta, transferir una alícuota de la muestra o del patrón a un matraz. Ajustar el matraz al extractor.

Enfriar a menos de -80 °C para que se congelen las muestras (los extractores equipados con tubos de apertura capilar no requieren esta etapa de congelado). A continuación, se produce el vacío en todo el sistema.

Una vez alcanzado un vacío estable, dejar que el patrón de CO₂ se distribuya en el interior de los matraces. Para inducir el proceso de equilibrio se utiliza un baño de agua a 25 °C (± 1 °C) durante 12 horas (por la noche). Es muy importante que la temperatura del baño de agua se mantenga constante y homogénea.

Una vez finalizado el proceso de equilibrado, transferir el CO₂ resultante de los matraces al fuelle regulador de la muestra del sistema de doble entrada. Las medidas se llevan a cabo por comparación de las relaciones isotópicas del CO₂ de la muestra y del patrón de CO₂ (situado en el fuelle regulador de patrón). Repetir hasta que se hayan medido todas las muestras de la serie.

8.3 Equilibrio inducido automáticamente

Con una pipeta, transferir una alícuota de la muestra o del patrón a un frasco. Los frascos de muestras se ajustan al aparato y se enfrían a menos de -80 °C para que se congelen las muestras (los sistemas equipados con tubos de apertura capilar no requieren esta etapa de congelado). A continuación, producir el vacío en todo el sistema.

Una vez alcanzado un vacío estable, se deja que el patrón de CO₂ se distribuya en los frascos. El equilibrio se alcanza a 22 ± 1 °C transcurridas 5 horas como mínimo y, a ser posible, con agitación suave. Dado que la duración del proceso depende de varios parámetros (por ejemplo, la forma del frasco, la temperatura y la agitación), el tiempo mínimo requerido ha de determinarse experimentalmente.

Una vez finalizado el proceso, el CO₂ resultante se transfiere de los frascos al fuelle regulador de la muestra del sistema de doble entrada. Las medidas se llevan a cabo por comparación de las relaciones isotópicas del CO₂ de la muestra y del patrón de CO₂ (situado en el fuelle regulador de patrón). Repetir hasta que se hayan medido todas las muestras de la serie.

8.4 Preparación manual para equilibrado manual y automático y análisis con doble entrada IRMS.

Introducir un volumen definido de muestra/estándar (ej. 200 µL) en un tubo de ensayo con ayuda de una pipeta. Los tubos de ensayo abiertos se colocan en una cámara cerrada que contiene el CO₂ utilizado para el equilibrado. Después de varias purgas para eliminar todo resto de aire, los tubos se cierran y se colocan en la bandeja con termostato del intercambiador de muestras. El equilibrado se alcanza después de al menos 8 horas a 40 °C. Una vez que se ha terminado el procedimiento de equilibrado, secar el CO₂ obtenido y transferir al lugar de la muestra del sistema de inducción con doble entrada. Las mediciones se realizan comparando varias veces las relaciones del CO₂ contenido en el lado de la muestra y en el lado estándar (CO₂ gas estándar de referencia) de la doble entrada. Este procedimiento se repite hasta que se haya medido la última muestra de la secuencia.

9. CALCULOS



10. RESULTADOS ESTADISTICOS

Valores (intensidad), sin ajuste con el MR


La repetibilidad (r) del método es del 0,40/00

La reproducibilidad (R) del método es del 0,60/00

11. ASPECTOS METODOLOGICOS

El sistema metodológico aplicado comprende la técnica analítica y el análisis de los datos arrojados por el instrumental correspondiente y resulta de estudios comparativos con la base de datos de referencia, que cubre todas las regiones del país, con un número de datos estadísticamente representativos y cualitativamente consistentes. Esta aplicación requiere considerar y ponderar la variabilidad entre los diferentes puntos estudiados por regiones en todo el territorio productivo nacional.

BIBLIOGRAFIA