GENERALIDADES:

El alcance de la presente normativa es referente a los diagnósticos obligatorios de enfermedades y nematodos transmitidos a plantines de frutilla producidos en clase de semilla fiscalizada o identificada.

Los laboratorios deberán contar con las condiciones ambientales, físicas y de equipamiento necesarias para el desarrollo de sus tareas, y podrán realizar sólo los ensayos para los cuales el INASE los haya habilitado.

Dichos ensayos deberán estar documentados en Protocolos con sus respectivos documentos de adopción del método. Estos documentos deberán ser presentados ante la Dirección de Evaluación de Calidad para su aprobación. Cualquier modificación posterior implicará la necesidad de un nuevo protocolo con su respectivo documento de adopción del método.

Asimismo, se recomienda que se tengan en cuenta las normas de higiene y seguridad y aquellas referidas al descarte seguro de residuos del laboratorio.

El Director Técnico deberá capacitar a los analistas dejando la debida constancia de dicha capacitación en el legajo del personal.

INSTALACIONES:

El área del laboratorio y cada una de sus dependencias debe ser compatible con el volumen de muestras que se procesen y con el personal disponible. Se debe establecer una separación eficaz entre zonas vecinas cuando se desarrollen en ellas actividades incompatibles, de forma que el acceso y el uso de todos los sectores sea definido y controlado. Estos sectores estarán detallados en un croquis en escala que deberá presentarse al momento de la solicitud de habilitación.

En función del o los análisis para los cuales el laboratorio desee estar habilitado se deberá disponer de:

• Sector de recepción e ingreso de muestras (independiente de los demás sectores).

• Sector de acondicionamiento y lavado de muestras.

• Sector para el análisis de virus.

•  Sector para análisis de nematodos.                      

•  Sector para análisis de hongos y oomycetes.

• Sector para almacenamiento de drogas.

• Sector para almacenamiento de materiales de vidrio y plástico.

• Sector para el lavado de material.

• Sector de archivo de muestras.

• Sector de oficina.

EQUIPAMIENTO Y MATERIALES DE REFERENCIA:

El laboratorio deberá estar provisto de todos los equipos y materiales de referencia o referencias necesarias para la correcta ejecución de los ensayos. Cada equipo deberá tener una ficha técnica que contenga toda la información necesaria del mismo, así como mantenimientos y calibraciones realizadas. Todos los equipos deberán ser mantenidos en adecuado estado de funcionamiento, debiendo para ello elaborarse un plan de mantenimiento de los mismos.

El material de referencia deberá estar debidamente identificado con las características técnicas que se consideren relevantes.

PROCEDIMIENTOS, REGISTROS Y DOCUMENTOS:

El laboratorio deberá mantener un sistema documental conforme al alcance de la habilitación en el que consten los siguientes registros:

• Protocolo de análisis virológico y documento de adopción del método.

• Registro de pruebas periódicas de dilución de anticuerpos utilizados.

• Protocolo de análisis nematológico y documento de adopción del método.

• Protocolo de análisis de hongos y oomycetes y documento de adopción del método.

• Registro de ingreso de muestras.

• Registro de análisis de virus (incluye boletín interno de análisis, lectura de lector ELISA/fotografías de placas).

• Registro de análisis de nematodos (boletín interno de análisis, fotografías si fuera posible).

• Registro de análisis de hongos y oomycetes (boletín interno de análisis, fotografías si fuera posible).

• Certificados de análisis emitidos.

• Registro de reactivos (facturas y/o remitos, fichas informativas que acompañan a los reactivos)

• Registro de equipos (listado de equipos, plan de mantenimiento, registros de controles, fichas técnicas).

• Registro de materiales de referencia o referencias usadas para la interpretación de los resultados (para el caso de análisis nematológicos, y de hongos y oomycetes.

Registro de ingreso de muestras: se registrarán en él todas las muestras que ingresen al laboratorio, se haya emitido certificado o no, con número correlativo (muestras de control interno de calidad, particulares, entrenamiento, test de referencia, muestras de fiscalización y otras). Los campos mínimos obligatorios que debe contener este registro y que deben ser completados son: número de muestra, código, fecha de recepción, remitente, procedencia u origen, especie, estado de la muestra, número de plantines enviados, análisis solicitados, fecha de inicio y final del análisis, fecha de emisión y número del certificado de análisis.

Registro de análisis (de virus, nematodos, y hongos y oomycetes): se elaborará un registro de análisis por cada muestra, el cual deberá estar identificado con el mismo número de ingreso que posee la muestra en el registro de ingreso de muestras.

El registro de análisis deberá contar con la siguiente información: número de ingreso de la muestra, determinaciones solicitadas, fecha de inicio y finalización del análisis, resultados obtenidos, metodología utilizada, datos e identificación del analista (si las etapas fueran desarrolladas por distintos analistas, cada uno deberá indicar la etapa que le corresponda mediante firma y aclaración o sus iniciales). Se recomienda dejar un espacio para anotar observaciones que hubiera del ensayo.

Informe de los resultados: los resultados de los ensayos solicitados se informarán en el "Certificado de Sanidad de Plantines de Frutilla" (Anexo IV).

Los resultados de virus y hongos y oomycetes se informarán con una sola cifra decimal (cuando el centésimo sea igual o superior a CINCO (5), el décimo informado será el inmediato superior; si el centésimo es inferior a CINCO (5), el décimo será el obtenido en el cálculo). Los resultados de nematodos se informarán como número de individuos en la muestra.

El laboratorio podrá completar únicamente aquellos campos de resultados para los que está habilitado.

Para aquellos análisis no realizados se deberá indicar en el campo correspondientes la leyenda N/A.

Archivo de Registros y Documentos:

Todos los registros, documentos y certificados emitidos deberán guardarse por un plazo de CINCO (5) años.


Las muestras recibidas deben ser identificadas con su respectivo número de ingreso.

Para análisis de virus se deberán procesar como mínimo OCHENTA Y CINCO (85) de cada CIEN (100) hojas de frutilla ingresadas. En el caso de análisis de nematodos y de hongos y oomycetes, se deberán procesar VEINTICINCO (25) plantines, debiéndose analizar, para el caso de hongos y oomycetes, plantín por plantín.

Una vez que las muestras ingresan al laboratorio, las mismas deben procesarse en el menor tiempo posible. En caso de no poder analizar las muestras inmediatamente, deberán conservarse en lugar seco y ventilado para evitar alteraciones en la calidad de las mismas que pudieran interferir con la correcta realización de los análisis.

La temperatura de conservación de las muestras no debe ser mayor a 15 °C y se deberán desechar los plantines y hojas que lleguen en mal estado.

Las muestras quedarán a total disposición del INASE, durante VEINTE (20) días corridos después de entregado el correspondiente Certificado de Análisis, lapso durante el cual deberán mantenerse en condiciones adecuadas de temperatura y humedad y protegidas de contaminaciones.


1) Equipamiento:

•  Micropipetas de volúmenes variables o varias de volúmenes fijos.

•  Peachímetro rango de pH de 0 a 14, resolución 0,01, error +/- 0,1.

•  Estufa de cultivo de temperatura regulable.

•  Sistema de extracción de jugo de las muestras: mecánico (extractor / dispensador de jugo de hoja) o manual con bolsas de plástico.

•  Balanzas analíticas, capacidad 120 gr, precisión 0,001 gr.

•  Heladera y Freezer (-20 °C).

•  Equipo para producción de agua destilada o similar (o en su defecto deberá contar con agua destilada).

•  Lector de microplaca (espectrofotómetro 405 nm) o cámara fotográfica y freezer.

Nota:

De optar por la cámara fotográfica y el freezer, la foto de la placa deberá garantizar la correcta identificación de los testigos positivos, sanos y blancos, permitir visualizar el resultado en cada celda y el número identificatorio del análisis.

Las placas deberán conservarse en freezer de -20 °C por un plazo de UN (1) año calendario.

2) Reactivos:

Los distintos reactivos empleados en los análisis de rutina deberán estar rotulados con: fecha de apertura del envase y fecha de vencimiento. Si se trata de soluciones preparadas en el laboratorio (como buffers), el rótulo deberá tener los siguientes datos: nombre de la solución, fecha de preparación, fecha de vencimiento, pH y nombre del analista que preparó la misma.

3) Material de Referencia:

• Testigos positivos.

• Testigos sanos.

• Blanco (Buffer).

El laboratorio deberá contar con los testigos positivos y sanos adecuados para conducir los ensayos.

En los casos en que se detecte que la intensidad de la reacción cambie con la variedad analizada; se deberá utilizar testigos positivos y sanos acordes a esa variedad al momento de la adopción del método.

5) Técnica ELISA:

El protocolo empleado dependerá de la marca comercial del kit utilizado por el laboratorio; debiendo el mismo estar documentado y adoptado. Se deberán tener en cuenta las siguientes consideraciones:

• La extracción se realizará a partir de hojas según el protocolo empleado por el laboratorio, con una dilución previamente determinada (por ejemplo, durante los ensayos para elaborar el documento de adopción del método).

• Prueba de diluciones de anticuerpos: se realizará cada vez que se abre un nuevo lote de anticuerpos y deberá emplearse un positivo de baja concentración.

• Sólo se permitirá el uso de anticuerpos policlonales.

• El número de testigos a emplear por placa, será como mínimo, el siguiente:

- testigos positivos (enfermos): DOS (2), uno de la menor concentración posible tal que se distinga del testigo sano y otro de una concentración mayor,

- testigos negativos (sanos): TRES (3),

- blanco (buffer): UNO (1).

• El agregado de azida sódica a los buffers permite su conservación durante DOS (2) meses. En caso contrario, se deberán usar dentro de las VEINTICUATRO (24) horas.

6) Interpretación de resultados:

El tiempo de lectura variará según la calidad de las placas usadas, el virus analizado y los anticuerpos empleados. Se podrá hacer una lectura preliminar a los TREINTA (30) minutos y la lectura final deberá ser a los SESENTA (60) minutos.

En cuanto a la lectura visual, se considerará muestra positiva a aquella que presente una coloración amarilla igual o superior a la del testigo positivo de menor concentración; y muestra negativa a la que tenga una coloración igual o menor a la del testigo sano.

En lo que respecta a las lecturas con lector de microplacas, se considerarán muestras positivas a aquellas cuyas lecturas de absorbancia a una longitud de onda de 405 nm (A405) sean superiores a la media de los TRES (3) testigos sanos, más TRES (3) veces el desvío estándar. Todas las muestras con valores de absorbancia menores a lo expresado serán consideradas sanas.

En caso de lecturas donde el cálculo arroje interpretaciones dudosas o confusas, la interpretación final de los resultados quedará a criterio del Director Técnico.


1) Equipamiento:

• Microscopio óptico (35X a 100X).

• Centrífuga (dependiendo del método empleado).

• Licuadora eléctrica.

• Tamices de distintas tramas.

• Balanza analítica.

• Estufa de cultivo.

• Autoclave.

• Agitador magnético.

• Flujo Laminar.

• Lupa binocular.

• Embudo de Baermann.

• Heladera.

• Peachímetro.

2) Determinación de Pratylenchus sp.

Procedimiento para extracción de nematodos:

1- Lavar cuidadosamente el material vegetal enfermo (raíces).

2- Cortar las raíces por la mitad longitudinalmente.

3- Licuar cada muestra con cantidad necesaria de agua, durante TREINTA (30) segundos.

4- Pasar el material licuado por una batería de tamices de 60, 100, 200 y 325 mesh.

5- Descartar el material retenido en los tamices de 60 y 100 mesh.

6- Transferir con una pizeta a un vaso de precipitado los nematodos y restos vegetales que quedaron en los tamices de 200 y 325 mesh.

Evaluación

- Directa:

• Colocar la suspensión obtenida en el punto 6 en una caja de Petri (9 cm de diámetro), procurando observar cada vez 2 a 3 cm3 de suspensión (volumen suficiente para cubrir con una delgada capa el fondo de las cajas). Este pequeño volumen facilita una mejor transparencia de la suspensión para la observación y recuento de los nematodos, bajo lupa binocular y/o microscopio.

• Proceder al recuento utilizando lupa binocular y/o microscopio. También es posible la coloración del material y su posterior observación directa bajo microscopio estereoscópico (empleando las técnicas de coloración en uso).

- Indirecta:

• Tomar la suspensión del punto 6, agitar el vaso y distribuirla equitativamente en los tubos de la centrífuga, uniformar el peso de todos los tubos en una balanza.

• Agregar a cada tubo 1 gr de caolín y agitar vigorosamente.

• Centrifugar a 3500 rpm durante TRES (3) minutos.

• Decantar cuidadosamente para eliminar el agua de los tubos y los restos de material vegetal, procurando perturbar al mínimo el precipitado que contiene caolín y a los nematodos.

• Llenar los tubos con una solución azucarada (454 gr azúcar/litro de agua) y resuspender en ella el precipitado que quedó en el fondo, agitando vigorosamente.

• Centrifugar nuevamente a 3000 rpm durante TRES (3) minutos. El caolín se sedimenta y los nematodos quedan suspendidos en la solución azucarada.

• Decantar la solución azucarada que contiene los nematodos sobre un tamiz de 325 o 400 mesh.

• Lavar rápidamente con agua para evitar que el agua azucarada dañe a los nematodos plasmolizándolos.

• Pasar cuidadosamente los nematodos a un vaso de precipitado con el agua de una pizeta.

• Volcar en caja de petri, procurando observar cada vez 2 a 3 cm3 de suspensión. Este pequeño volumen facilita una mejor transparencia de la suspensión para la observación y recuento de los nematodos, bajo lupa binocular y/o microscopio.


1) Equipamiento:

• Estufa de cultivo.

• Autoclave.

• Centrífuga.

• Microscopio óptico.

• Cámara de fotos para microscopio.

• Heladera.

• Balanza.

• Lupa.

2) Protocolo:

Tal como se menciona en el Anexo II-C, los protocolos a utilizar para la determinación de hongos y oomycetes deberán enviarse a la Dirección de Evaluación de Calidad al solicitar la habilitación del laboratorio. Asimismo, se deberá enviar la metodología detallada, junto con la clave de identificación a emplear para la clasificación y las fotografías correspondientes.