ANEXO III
NORMAS DE FUNCIONAMIENTO DE LABORATORIOS DE ANÁLISIS FITOSANITARIOS DE PLANTINES DE FRUTILLA
DISPOSICIONES GENERALES:
GENERALIDADES:
El alcance de la presente normativa es referente a los diagnósticos
obligatorios de enfermedades y nematodos transmitidos a plantines de
frutilla producidos en clase de semilla fiscalizada o identificada.
Los laboratorios deberán contar con las condiciones ambientales,
físicas y de equipamiento necesarias para el desarrollo de sus tareas,
y podrán realizar sólo los ensayos para los cuales el INASE los haya
habilitado.
Dichos ensayos deberán estar documentados en Protocolos con sus
respectivos documentos de adopción del método. Estos documentos deberán
ser presentados ante la Dirección de Evaluación de Calidad para su
aprobación. Cualquier modificación posterior implicará la necesidad de
un nuevo protocolo con su respectivo documento de adopción del método.
Asimismo, se recomienda que se tengan en cuenta las normas de higiene y
seguridad y aquellas referidas al descarte seguro de residuos del
laboratorio.
El Director Técnico deberá capacitar a los analistas dejando la debida
constancia de dicha capacitación en el legajo del personal.
INSTALACIONES:
El área del laboratorio y cada una de sus dependencias debe ser
compatible con el volumen de muestras que se procesen y con el personal
disponible. Se debe establecer una separación eficaz entre zonas
vecinas cuando se desarrollen en ellas actividades incompatibles, de
forma que el acceso y el uso de todos los sectores sea definido y
controlado. Estos sectores estarán detallados en un croquis en escala
que deberá presentarse al momento de la solicitud de habilitación.
En función del o los análisis para los cuales el laboratorio desee estar habilitado se deberá disponer de:
• Sector de recepción e ingreso de muestras (independiente de los demás sectores).
• Sector de acondicionamiento y lavado de muestras.
• Sector para el análisis de virus.
• Sector para análisis de
nematodos.
• Sector para análisis de hongos y oomycetes.
• Sector para almacenamiento de drogas.
• Sector para almacenamiento de materiales de vidrio y plástico.
• Sector para el lavado de material.
• Sector de archivo de muestras.
• Sector de oficina.
EQUIPAMIENTO Y MATERIALES DE REFERENCIA:
El laboratorio deberá estar provisto de todos los equipos y materiales
de referencia o referencias necesarias para la correcta ejecución de
los ensayos. Cada equipo deberá tener una ficha técnica que contenga
toda la información necesaria del mismo, así como mantenimientos y
calibraciones realizadas. Todos los equipos deberán ser mantenidos en
adecuado estado de funcionamiento, debiendo para ello elaborarse un
plan de mantenimiento de los mismos.
El material de referencia deberá estar debidamente identificado con las características técnicas que se consideren relevantes.
PROCEDIMIENTOS, REGISTROS Y DOCUMENTOS:
El laboratorio deberá mantener un sistema documental conforme al
alcance de la habilitación en el que consten los siguientes registros:
• Protocolo de análisis virológico y documento de adopción del método.
• Registro de pruebas periódicas de dilución de anticuerpos utilizados.
• Protocolo de análisis nematológico y documento de adopción del método.
• Protocolo de análisis de hongos y oomycetes y documento de adopción del método.
• Registro de ingreso de muestras.
• Registro de análisis de virus (incluye boletín interno de análisis, lectura de lector ELISA/fotografías de placas).
• Registro de análisis de nematodos (boletín interno de análisis, fotografías si fuera posible).
• Registro de análisis de hongos y oomycetes (boletín interno de análisis, fotografías si fuera posible).
• Certificados de análisis emitidos.
• Registro de reactivos (facturas y/o remitos, fichas informativas que acompañan a los reactivos)
• Registro de equipos (listado de equipos, plan de mantenimiento, registros de controles, fichas técnicas).
• Registro de materiales de referencia o referencias usadas para la
interpretación de los resultados (para el caso de análisis
nematológicos, y de hongos y oomycetes.
Registro de ingreso de muestras:
se registrarán en él todas las muestras que ingresen al laboratorio, se
haya emitido certificado o no, con número correlativo (muestras de
control interno de calidad, particulares, entrenamiento, test de
referencia, muestras de fiscalización y otras). Los campos mínimos
obligatorios que debe contener este registro y que deben ser
completados son: número de muestra, código, fecha de recepción,
remitente, procedencia u origen, especie, estado de la muestra, número
de plantines enviados, análisis solicitados, fecha de inicio y final
del análisis, fecha de emisión y número del certificado de análisis.
Registro de análisis (de virus, nematodos, y hongos y oomycetes):
se elaborará un registro de análisis por cada muestra, el cual deberá
estar identificado con el mismo número de ingreso que posee la muestra
en el registro de ingreso de muestras.
El registro de análisis deberá contar con la siguiente información:
número de ingreso de la muestra, determinaciones solicitadas, fecha de
inicio y finalización del análisis, resultados obtenidos, metodología
utilizada, datos e identificación del analista (si las etapas fueran
desarrolladas por distintos analistas, cada uno deberá indicar la etapa
que le corresponda mediante firma y aclaración o sus iniciales). Se
recomienda dejar un espacio para anotar observaciones que hubiera del
ensayo.
Informe de los resultados: los resultados de los ensayos solicitados se informarán en el "Certificado de Sanidad de Plantines de Frutilla" (Anexo IV).
Los resultados de virus y hongos y oomycetes se informarán con una sola
cifra decimal (cuando el centésimo sea igual o superior a CINCO (5), el
décimo informado será el inmediato superior; si el centésimo es
inferior a CINCO (5), el décimo será el obtenido en el cálculo). Los
resultados de nematodos se informarán como número de individuos en la
muestra.
El laboratorio podrá completar únicamente aquellos campos de resultados para los que está habilitado.
Para aquellos análisis no realizados se deberá indicar en el campo correspondientes la leyenda N/A.
Archivo de Registros y Documentos:
Todos los registros, documentos y certificados emitidos deberán guardarse por un plazo de CINCO (5) años.
MUESTRAS PARA ANÁLISIS:
Las muestras recibidas deben ser identificadas con su respectivo número de ingreso.
Para análisis de virus se deberán procesar como mínimo OCHENTA Y CINCO
(85) de cada CIEN (100) hojas de frutilla ingresadas. En el caso de
análisis de nematodos y de hongos y oomycetes, se deberán procesar
VEINTICINCO (25) plantines, debiéndose analizar, para el caso de hongos
y oomycetes, plantín por plantín.
Una vez que las muestras ingresan al laboratorio, las mismas deben
procesarse en el menor tiempo posible. En caso de no poder analizar las
muestras inmediatamente, deberán conservarse en lugar seco y ventilado
para evitar alteraciones en la calidad de las mismas que pudieran
interferir con la correcta realización de los análisis.
La temperatura de conservación de las muestras no debe ser mayor a 15
°C y se deberán desechar los plantines y hojas que lleguen en mal
estado.
Las muestras quedarán a total disposición del INASE, durante VEINTE
(20) días corridos después de entregado el correspondiente Certificado
de Análisis, lapso durante el cual deberán mantenerse en condiciones
adecuadas de temperatura y humedad y protegidas de contaminaciones.
ANÁLISIS VIROLÓGICOS:
1) Equipamiento:
• Micropipetas de volúmenes variables o varias de volúmenes fijos.
• Peachímetro rango de pH de 0 a 14, resolución 0,01, error +/- 0,1.
• Estufa de cultivo de temperatura regulable.
• Sistema de extracción de jugo de las muestras: mecánico
(extractor / dispensador de jugo de hoja) o manual con bolsas de
plástico.
• Balanzas analíticas, capacidad 120 gr, precisión 0,001 gr.
• Heladera y Freezer (-20 °C).
• Equipo para producción de agua destilada o similar (o en su defecto deberá contar con agua destilada).
• Lector de microplaca (espectrofotómetro 405 nm) o cámara fotográfica y freezer.
Nota:
De optar por la cámara fotográfica y el freezer, la foto de la placa
deberá garantizar la correcta identificación de los testigos positivos,
sanos y blancos, permitir visualizar el resultado en cada celda y el
número identificatorio del análisis.
Las placas deberán conservarse en freezer de -20 °C por un plazo de UN (1) año calendario.
2) Reactivos:
Los distintos reactivos empleados en los análisis de rutina deberán
estar rotulados con: fecha de apertura del envase y fecha de
vencimiento. Si se trata de soluciones preparadas en el laboratorio
(como buffers), el rótulo deberá tener los siguientes datos: nombre de
la solución, fecha de preparación, fecha de vencimiento, pH y nombre
del analista que preparó la misma.
3) Material de Referencia:
• Testigos positivos.
• Testigos sanos.
• Blanco (Buffer).
El laboratorio deberá contar con los testigos positivos y sanos adecuados para conducir los ensayos.
En los casos en que se detecte que la intensidad de la reacción cambie
con la variedad analizada; se deberá utilizar testigos positivos y
sanos acordes a esa variedad al momento de la adopción del método.
5) Técnica ELISA:
El protocolo empleado dependerá de la marca comercial del kit utilizado
por el laboratorio; debiendo el mismo estar documentado y adoptado. Se
deberán tener en cuenta las siguientes consideraciones:
• La extracción se realizará a partir de hojas según el protocolo
empleado por el laboratorio, con una dilución previamente determinada
(por ejemplo, durante los ensayos para elaborar el documento de
adopción del método).
• Prueba de diluciones de anticuerpos: se realizará cada vez que se
abre un nuevo lote de anticuerpos y deberá emplearse un positivo de
baja concentración.
• Sólo se permitirá el uso de anticuerpos policlonales.
• El número de testigos a emplear por placa, será como mínimo, el siguiente:
- testigos positivos (enfermos): DOS (2), uno de la menor concentración
posible tal que se distinga del testigo sano y otro de una
concentración mayor,
- testigos negativos (sanos): TRES (3),
- blanco (buffer): UNO (1).
• El agregado de azida sódica a los buffers permite su conservación
durante DOS (2) meses. En caso contrario, se deberán usar dentro de las
VEINTICUATRO (24) horas.
6) Interpretación de resultados:
El tiempo de lectura variará según la calidad de las placas usadas, el
virus analizado y los anticuerpos empleados. Se podrá hacer una lectura
preliminar a los TREINTA (30) minutos y la lectura final deberá ser a
los SESENTA (60) minutos.
En cuanto a la lectura visual, se considerará muestra positiva a
aquella que presente una coloración amarilla igual o superior a la del
testigo positivo de menor concentración; y muestra negativa a la que
tenga una coloración igual o menor a la del testigo sano.
En lo que respecta a las lecturas con lector de microplacas, se
considerarán muestras positivas a aquellas cuyas lecturas de
absorbancia a una longitud de onda de 405 nm (A405) sean superiores a
la media de los TRES (3) testigos sanos, más TRES (3) veces el desvío
estándar. Todas las muestras con valores de absorbancia menores a lo
expresado serán consideradas sanas.
En caso de lecturas donde el cálculo arroje interpretaciones dudosas o
confusas, la interpretación final de los resultados quedará a criterio
del Director Técnico.
ANÁLISIS NEMATOLÓGICO:
1) Equipamiento:
• Microscopio óptico (35X a 100X).
• Centrífuga (dependiendo del método empleado).
• Licuadora eléctrica.
• Tamices de distintas tramas.
• Balanza analítica.
• Estufa de cultivo.
• Autoclave.
• Agitador magnético.
• Flujo Laminar.
• Lupa binocular.
• Embudo de Baermann.
• Heladera.
• Peachímetro.
2) Determinación de Pratylenchus sp.
Procedimiento para extracción de nematodos:
1- Lavar cuidadosamente el material vegetal enfermo (raíces).
2- Cortar las raíces por la mitad longitudinalmente.
3- Licuar cada muestra con cantidad necesaria de agua, durante TREINTA (30) segundos.
4- Pasar el material licuado por una batería de tamices de 60, 100, 200 y 325 mesh.
5- Descartar el material retenido en los tamices de 60 y 100 mesh.
6- Transferir con una pizeta a un vaso de precipitado los nematodos y
restos vegetales que quedaron en los tamices de 200 y 325 mesh.
Evaluación
- Directa:
• Colocar la suspensión obtenida en el punto 6 en una caja de Petri (9
cm de diámetro), procurando observar cada vez 2 a 3 cm3 de suspensión
(volumen suficiente para cubrir con una delgada capa el fondo de las
cajas). Este pequeño volumen facilita una mejor transparencia de la
suspensión para la observación y recuento de los nematodos, bajo lupa
binocular y/o microscopio.
• Proceder al recuento utilizando lupa binocular y/o microscopio.
También es posible la coloración del material y su posterior
observación directa bajo microscopio estereoscópico (empleando las
técnicas de coloración en uso).
- Indirecta:
• Tomar la suspensión del punto 6, agitar el vaso y distribuirla
equitativamente en los tubos de la centrífuga, uniformar el peso de
todos los tubos en una balanza.
• Agregar a cada tubo 1 gr de caolín y agitar vigorosamente.
• Centrifugar a 3500 rpm durante TRES (3) minutos.
• Decantar cuidadosamente para eliminar el agua de los tubos y los
restos de material vegetal, procurando perturbar al mínimo el
precipitado que contiene caolín y a los nematodos.
• Llenar los tubos con una solución azucarada (454 gr azúcar/litro de
agua) y resuspender en ella el precipitado que quedó en el fondo,
agitando vigorosamente.
• Centrifugar nuevamente a 3000 rpm durante TRES (3) minutos. El caolín
se sedimenta y los nematodos quedan suspendidos en la solución
azucarada.
• Decantar la solución azucarada que contiene los nematodos sobre un tamiz de 325 o 400 mesh.
• Lavar rápidamente con agua para evitar que el agua azucarada dañe a los nematodos plasmolizándolos.
• Pasar cuidadosamente los nematodos a un vaso de precipitado con el agua de una pizeta.
• Volcar en caja de petri, procurando observar cada vez 2 a 3 cm3 de
suspensión. Este pequeño volumen facilita una mejor transparencia de la
suspensión para la observación y recuento de los nematodos, bajo lupa
binocular y/o microscopio.
ANÁLISIS DE HONGOS Y OOMYCETES EN PLANTINES DE FRUTILLA
1) Equipamiento:
• Estufa de cultivo.
• Autoclave.
• Centrífuga.
• Microscopio óptico.
• Cámara de fotos para microscopio.
• Heladera.
• Balanza.
• Lupa.
2) Protocolo:
Tal como se menciona en el Anexo II-C, los protocolos a utilizar para
la determinación de hongos y oomycetes deberán enviarse a la Dirección
de Evaluación de Calidad al solicitar la habilitación del laboratorio.
Asimismo, se deberá enviar la metodología detallada, junto con la clave
de identificación a emplear para la clasificación y las fotografías
correspondientes.
IF-2022-49213414-APN-INASE#MAGYP
ANEXO IV
IF-2022-49214357-APN-INASE#MAGYP