Bs. As., 25/9/2000

VISTO el expediente N° 6270/99 del registro del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, la Resolución N° 1 de fecha 3 de enero de 1983 del registro del ex-SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL, la Resolución N° 115 de fecha 1° de marzo de 1999 de la SECRETARIA DE AGRICULTURA, GANADERIA, PESCA Y ALIMENTACION, la Resolución N° 274 de fecha 9 de junio de 1983 de la ex-SECRETARIA DE AGRICULTURA Y GANADERIA y la Resolución N° 205 de fecha 17 de abril de 1996 del ex-SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL, y

CONSIDERANDO:

Que por la Resolución N° 1/83 del registro del ex-SENASA se establecen los procedimientos de aprobación de Tuberculina P.P.D. Bovina.

Que por la Resolución N° 115/99 de la SECRETARIA DE AGRICULTURA, GANADERIA, PESCA Y ALIMENTACION, se impone el Programa Nacional de Control y Erradicación de la Brucelosis y Tuberculosis Bovina.

Que la implementación del mencionado Programa Nacional, incrementará sensiblemente la disponibilidad del número de series de Tuberculina P.P.D. Bovina intradérmica.

Que el éxito del programa depende, entre otras cosas, de la sensibilidad y especificidad de las pruebas diagnósticas y de la calidad de los reactivos utilizados.

Que el principal costo del Programa lo constituye la segregación de los animales reactores, siendo por lo tanto imprescindible asegurar la calidad adecuada de la Tuberculina que se libere al mercado.

Que por todo lo expuesto, la certificación de aprobación de las series de Tuberculina constituye un asunto que involucra intereses nacionales de importancia y que por lo tanto, deben asegurarse mecanismos transparentes, auditables y verificables.

Que la Dirección Nacional de Sanidad Animal y la Comisión Nacional de Brucelosis y Tuberculosis fueron puestas en conocimiento, teniéndose en cuenta las observaciones realizadas.

Que la Dirección de Asuntos Jurídicos ha tomado la intervención que le compete (fojas 119), no encontrando reparos de orden legal que formular.

Que el suscripto es competente de acuerdo a lo establecido en los artículos 8°, inciso h) y 9°, inciso a) del Decreto N° 1585 del 19 de diciembre de 1996 y el artículo 4° de la Resolución N° 115 de fecha 1° de marzo de 1999 de la SECRETARIA DE AGRICULTURA, GANADERIA, PESCA Y ALIMENTACION.

Por ello,

EL VICEPRESIDENTE EJECUTIVO DEL SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA

RESUELVE:

Artículo 1° — Apruébanse las series de Tuberculina P.P.D. Bovina, una vez cumplimentados todos los seguimientos mencionados en la presente resolución, a través de la Coordinación General de Laboratorio Animal de la Dirección de Laboratorios y Control Técnico (DILACOT) del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA.

Art. 2° — Las pruebas de potencia dispuestas en el Anexo que forma parte integrante de la presente resolución, deberán realizarse en la Dirección de Laboratorios y Control Técnico del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, o en los lugares que la Dirección de Laboratorios y Control Técnico determine.

Art. 3° — Se realizarán por sorteo, ensayos de potencia interlaboratorios y de eficacia sobre animales de la especie bovina, según protocolos que forman parte integrante de la presente y que a tales efectos estableció la Coordinación General de Laboratorio Animal, de manera independiente de los procedimientos de aprobación de series de Tuberculina P.P.D. Bovina establecidos en el Anexo de la presente resolución.

Art. 4° — Comuníquese, publíquese, dése a la Dirección Nacional del Registro Oficial y archívese. — Víctor E. Machinea.

ANEXO

PROCEDIMIENTOS DE APROBACION Y CONTROL DE SERIES DE TUBERCULINA P.P.D. BOVINA

Reconocimientos:

El presente Anexo fue extractado del "Manual de Procedimientos Técnicos de Producción y Control de Tuberculina Bovina —Derivado Proteico Purificado— P.P.D." del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, normas de Organismos Internacionales de referencia y el INSTITUTO PANAMERICANO DE PROTECCION DE ALIMENTOS Y ZOONOSIS (INPPAZ).

Determinación de la Potencia Biológica:

Se realiza en cobayos previamente sensibilizados.

Con la suspensión del Anexo VI (página 51 Manual de Procedimientos Técnicos - Producción y Control de Tuberculina Bovina - Derivado Proteico Purificado - P.P.D. - DILACOT - SENASA 1998), inocular a cada cobayo con CERO CON CINCO MILILITROS (0,5 ML) por vía intramuscular utilizando jeringas con camisa y émbolo de vidrio de UN MILILITRO (1 ml), adaptador de rosca tipo Luerlock y aguja VEINTE (20) SWG x DIECIOCHO MILIMETROS (18 mm).

Después de realizado este procedimiento, autoclavar todo el material utilizado a CIENTO VEINTE GRADO CENTIGRADOS (120°C) durante TREINTA (30) minutos.

Dejar transcurrir TREINTA (30) días hasta su utilización.

Los cobayos así sensibilizados se pueden utilizar hasta SEIS (6) meses posteriores a la inoculación.

Estándar Internacional:

Basado en un ensayo colaborativo internacional en cobayos y bovinos en el año 1986, la ORGANIZACION MUNDIAL DE LA SALUD (OMS) entregó oficialmente el estándar internacional de Tuberculina P.P.D. Bovina: TREINTA Y DOS MIL QUINIENTAS UNIDADES INTERNACIONALES POR MILIGRAMO POR MILILITRO (32.500 UI/mg/ml), corresponden a UN MILIGRAMO (1 mg) de Tuberculina PPD Bovina.

La potencia estimada de Tuberculina Bovina deberá ser no inferior al SESENTA Y SEIS POR CIENTO (66%) ni mayor del CIENTO CINCUENTA POR CIENTO (150%).

A los fines de no utilizar en forma continua este reactivo biológico, es necesario que los países establezcan su propio patrón de referencia nacional calibrado contra el estándar internacional en cobayos y bovinos.

Para los sucesivos controles en los lotes de tuberculinas producidos por la actividad privada u oficial, los mismos serán realizados con la serie establecida de referencia nacional.

Procedimiento:

En cobayos sensibilizados en la cepa AN de Mycobacterium bovis, realizar la depilación mediante afeitadora y crema depilatoria de ambos flancos de cada animal, CUATRO (4) horas antes de la prueba de potencia.

Diluciones de la Tuberculina:

Realizar este esquema con la tuberculina de referencia y con la serie en control.

Mezclar bien los matraces aforados, pasar a tubo de ensayo con tapón de goma reversible para poder llenar las jeringas. Enjuagar cada jeringa con la dilución DOS (2) o TRES (3) veces antes de llenarlas, finalmente enrasarlas y colocarlas numeradas en una bandeja. Se inyecta CERO CON DOS MILILITROS (0,2 ml) por dilución. TRES (3) diluciones a cada lado del cobayo. Se numeran de UNO (1) a TRES (3) para la preparación de referencia y de CUATRO (4) a (SEIS) (6) para la tuberculina de prueba.

Ensayo de las Tuberculinas de referencia y en Prueba:

Inoculaciones. Prueba de actividad relativa. Potencia:

SEIS (6) sitios a usar en cada cobayo (TRES (3) en cada flanco) son denominados, en sentido oral a caudal, con las letras "a", "b", "c" para el costado izquierdo y "e", "f", "g" para el derecho. La dilución de la tuberculina a ser aplicada en cada sitio se determina mediante el empleo de números aleatorios. Este procedimiento se sigue para cada animal y se preparará el protocolo de trabajo (Tabla I) dejando un espacio al lado del número de la dilución para anotar la respuesta. En un ensayo de SEIS (6) puntos usando NUEVE (9) cobayos, las diluciones son asignadas en forma conveniente en los sitios de inyección, empleando el sistema de cuadrado latino. Transcurridas VEINTICUATRO (24) horas se realiza la lectura de la pápula, induración y eritema, mediante una plantilla plástica y/o regla plástica milimetrada. Los datos consignados en la Tabla I se vuelcan a un programa informático de Cálculo numérico de la actividad relativa en el sistema operativo WINDOWS 95’, producido por el INSTITUTO PANAMERICANO DE PROTECCION DE ALIMENTOS Y ZOONOSIS (INPPAZ), en colaboración con la DILACOT-SENASA.

Esterilidad:

El producto debe estar libre de toda contaminación, para ello es controlado en medios de cultivos para aero-anaerobios y para el desarrollo de hongos.

Esto se realizará según el "Test for sterility and freedom contamination of biological material, Chapter 1.4, pág. 16 y 17, Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vacines - 1996 – OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES.

Ausencia de gérmenes:

Se centrifuga una muestra de QUINCE MILILITROS (15 ml) de la Tuberculina P.P.D. en control, con el sedimento se preparan DOS (2) frotis: UNO (1) para colaboración de ácido - alcohol resistencia de Ziehl-Neelsen y UNO (1) para coloración de Gram.

No se debe observar la presencia de gérmenes en ninguno de los preparados.

Control de toxicidad:

Se inoculan CERO CON CINCO MILILITROS (0,5 ml) de la tuberculina en control, por vía subcutánea, a CUATRO (4) cobayos que no han sido tratados previamente con material antigénico. Al cabo de CUATRO (4) días los animales no deben presentar alteración alguna.

Potencial de hidrógeno (pH):

Debe estar comprendido en el rango de SIETE CON CERO MAS MENOS CERO CON TRES (7.0 +,- 0.3).

Control químico:

La concentración proteica será determinada por métodos químicos, tales como Biuret, Kjeldhal, semi micro Kjeldhal, etc., que permitan establecer el nitrógeno proteico.

Reacción del biuret: Es positiva para las proteínas y sus productos de hidrólisis parcial, siendo propia aunque "no específica" de la unión peptídica, y es presentada por moléculas que contienen DOS (2) grupo — CO-NH (carbamilo) unidos directamente por UN (1) átomo de carbono o de nitrógeno.

El biuret es la ureída (amida de la urea) del ácido carbónico:

H ₂ N — CO — NH — CO – NH ₂

Las proteínas con largas cadenas peptídicas dan coloración azul violeta, y a medida que la cadena se acorta, la coloración tiende hacia el rojo.

Es probable que el desarrollo de color se deba a la formación de complejos de coordinación con el cobre del tipo de:

Los péptidos y las proteínas originan una coloración azul debida a los grupos NH ₂ libres y amarilla o roja por los grupos: NH — CO — NH, la resultante es una coloración violeta.

Método del Biuret (modificado): De acuerdo a la concentración estimada entre CERO CON CINCO MILIGRAMOS POR MILILITRO (0,5 mg/ml) a CUATRO MILIGRAMOS POR MILILITRO (4 mg/ml), realizar la siguiente distribución:

Blanco de reactivos: CINCO MILILITROS (5 ml) de agua destilada más CINCO MILILITROS (5 ml) de reactivo de Biuret.

Mezclar los componentes y dejar a temperatura ambiente durante DIEZ (10) minutos para el desarrollo de color.

Leer en un espectrofotómetro a SEISCIENTOS VEINTICINCO NANOMETROS (625 nm)

La concentración proteica de la muestra sera:

Absorbancia de la muestra x concentración de la tuberculina de referencia en =

Absorbancia de la tuberculina de referencia mg/ml y el factor de dilución.

Método semimicro de Kjeldahl: Por la digestión en Acido Sulfúrico, el Nitrógeno en la Tuberculina es convertido en Sulfato de Amonio. En la alcanilización y destilación al vapor, el amoníaco es llevado a una solución de Acido Bórico. El Nitrógeno es determinado por titulación con solución estándar de SO ₄ H ₂ . La multiplicación del valor Nitrógeno por un factor SIETE (7) expresa la cantidad de proteína en la muestra.

Todas las determinaciones son de P.P.D. de Tuberculina precipitable.

Las muestras se realizan por cuadriplicado y se incluyen DOS (2) controles.

No se deberá conservar o usar amoníaco en ningún lugar cercano al área donde se efectúa esta determinación.

Método.

Colocar cada muestra y cada control en un tubo cónico de centrífuga de DIEZ MILILITROS (10 ml), numerándose cada tubo para su identificación:

(*) Se puede utilizar en su lugar agua destilada

Colocar en el tubo de centrífuga, según el orden indicado. Después del mezclado del contenido dejar los tubos en reposo (cubiertos) a temperatura ambiente durante TREINTA (30) minutos.

Centrifugar a DOS MIL REVOLUCIONES POR MINUTO (2.000 rpm) durante QUINCE (15) minutos.

Decantar cuidadosamente y separar el sobrenadante.

Disolver la proteína precipitada de cada tubo en CERO CON CINCO MILILITROS (0,5 ml) de solución CINCO NORMAL (5N) de OHNa, lavando los costados del tubo por rotación en posición caso horizontal.

Una pequeña cantidad de proteína se adhiere en el lateral del tubo formando un anillo sobre el mismo en la superficie del líquido.

Cuando está completamente disuelto, lavar la solución de tuberculina de cada tubo en un matraz de Kjeldahl correspondiente a la numeración, usando SEIS (6); transferir cada muestra con UN MILILITRO (1 ml) de agua destilada.

A la solución de cada Kjeldahl, añadir:

• H₂ SO ₄ concentrado: UN MILILITRO (1 ml) aproximadamente.
• TRES (3) esferitas de vidrio.

Digerir sobre un mechero de gas. Después que ha hervido el agua, continuar calentando hasta la aparición de un depósito marrón.

Clarificar por agregado a cada recipiente (incluidos los controles que no muestran depósito marrón) de CERO CON CINCO MILILITROS (0,5 ml) de H ₂ O ₂ (CIEN (100) volúmenes).

Continuar calentando. Si aparece un depósito, añadir otros CERO CON CINCO MILILITROS (0,5 ml) de H ₂ O ₂ a cada recipiente de manera que cada uno reciba la misma cantidad.

Continuar calentando hasta que el SO ₄ H ₂ comienza a destilar en el cuello del matraz, mantener el calentamiento durante DIEZ (10) minutos. Se produce una conversión de NOVENTA Y OCHO POR CIENTO (98%) de Nitrógeno a Sulfato de Amonio. El color del líquido en los matraces de Kjeldahl deberá ser verde claro antes de retirar la llama de gas.

La etapa siguiente es la destilación por calor en el aparato de Markman. El agua del generador de vapor estará ligeramente acidificada con Acido Fosfórico. Cargar DIEZ MILILITROS (10 ml) de Acido Bórico al DOS POR CIENTO (2%) conteniendo indicador de Conway en la cámara de destilación y destilar al vapor durante CINCO (5) minutos.

Retirar esta carga y reemplazar con una nueva carga y destilar como antes. Si hubiera cualquier cambio en el color de la misma, repetir este procedimiento hasta que el color rojo de la solución de Acido Bórico permanezca invariable. Destilar por vapor durante CINCO (5) minutos con una carga de agua destilada. El aparato de Markman está ahora listo para ser usado.

Colocar un frasco cónico de CINCUENTA MILILITROS (50 ml) conteniendo CINCO MILILITROS (5 ml) de una solución al DOS POR CIENTO (2%) de Acido Bórico e indicador de Conway debajo de la salida del condensador.

Usar CINCO (5) veces, UN MILILITRO (1 ml) de agua destilada, lavar los contenidos de un matraz de Kjeldahl en la cámara de destilación de Markman.

Con cuidado agregar CINCO MILILITROS (5 ml) de una solución al CINCUENTA POR CIENTO (50%) de OHNa para formar una capa profunda. Acomodar el tapón de la cámara.

Levantar el frasco cónico colector de modo que la salida del condensador gotee debajo de la superficie de la solución de Acido Bórico.

Destilar al vapor la muestra durante TRES (3) minutos. Después de la destilación, inmediatamente bajar el recipiente colector de modo que la superficie del líquido esté apartada de la salida del condensador en el frasco colector usando unos DOS MILILITROS (2 ml) de agua destilada.

El proceso de destilación deberá haber triplicado aproximadamente el volumen del líquido en el frasco colector.

El destilado debe estar frío, para ello, hacer pasar gran cantidad de agua fría a través del condensador.

Con una muestra de P.P.D. de tuberculina, el contenido del frasco colector será ahora verde, pero con un testigo el color será generalmente ligeramente rojo.

Titular de inmediato con solución ONCE CON DOS NORMAL (11.2 N) SO ₄ H ₂ en una microbureta de CINCO MILILITROS (5 ml) hasta que el color original rojo justo reaparezca.

Observe el volumen de solución de SO 4 H 2 usado.

Cargar la cámara de destilación del aparato de Markman con unos DIEZ MILILITROS (10 ml) de agua destilada y destilar al vapor durante DOS O TRES (2 o 3) minutos antes de introducir la muestra siguiente.

Tratar todas las muestras y controles tal lo descripto anteriormente.

Observe que después de cada destilación, la condensación del vapor separa al líquido de la cámara de destilación.

Cuando esto ha sucedido, la llave de remoción del vapor debe abrirse antes de introducir otra muestra, de otro modo la muestra se perderá.

Colocar el nitrógeno estándar por el pipeteado de UN MILILITRO (1 ml) de solución de Sulfato de Amonio directamente en la cámara de Markman, lavando con unos CINCO MILILITROS (5 ml) de agua destilada, añadiendo CINCO MILILITROS (5 ml) de solución al CINCUENTA POR CIENTO (50%) de OHNa y destilar al vapor tal como para las muestras y controles. Esto debería titularse con OCHO MILILITROS (8 ml) de una solución ONCE CON DOS NORMAL (11.2 N) de SO ₄ H ₂ .

El ejemplo siguiente muestra el orden en el cual las destilaciones y las titulaciones se efectúan y en la forma en que se obtienen los resultados en términos de miligramos de P.P.D. de Tuberculina/ mililitro. Se trabajó sobre DOS MILILITROS (2 ml) de muestra.

NOTA: Estas titulaciones del control son valores altos. Normalmente no deberían exceder de CERO CON UN MILILITRO (0,1 ml). En los casos como el descripto, el color del Acido Bórico será definitivamente verde.

Muy a menudo los controles son tan bajos como CERO CON CERO UN MILILITROS (0,01 ml); CERO CON CERO CINCO MILILITROS (0,05 ml) o aún CERO (0) y entonces, por supuesto el color del Acido Bórico permanece rojo.

Aunque el Nitrógeno estándar está indicado en el frasco N° 2, es aconsejable destilar este al finalizar, evitando con ello pasar posible Nitrógeno a muestras subsiguientes.

Con este método los resultados son exactos en un MAS MENOS CINCO POR CIENTO +,- 5%).

Cálculos:

Dividir por la cantidad de mililitros de SO ₄ H ₂ estándar equivalente a 1 mg de Nitrógeno = 0,580.

Multiplicar por el factor de conversión 7 = 4,060

Dividir por la cantidad de mililitros empleados en cada muestra = 2,03

Por lo tanto, contenido de P.P.D. = 2,03 mg/ml

Reacción:

H ₃ Bo ₃ + 3 NH ₄ OH ———— (NH ₄ ) 3 Bo ₃ + H 2 O + exceso de Bo ₃ H ₃

2 (NH ₄ ) 3 Bo ₃ + 3 H ₂ SO ₄ ——— 3 (NH ₄ ) 2 SO ₄ + 2 H ₃ Bo ₃

1 ml N/11.2 H ₂ SO ₄ = 0.125 mg Nitrógeno.

Por lo tanto, 1 mg. Nitrógeno = 8.0 ml N/11.2 H ₂ SO ₄

Multiplicar el valor del Nitrógeno por factor P.P.D. = 7

Expresar el resultado en mg P.P.D./ml de solución.

Contenido de fenol y de otros agentes conservadores:

Si se ha utilizado fenol, la concentración deberá estar en QUINIENTOS MILIGRAMOS POR CIENTO (500 mg%).

El método usado para su determinación es mediante el reactivo de Folin-Ciocalteau.

El complejo de ácido fosfotúngstico, en medio alcalino, es reducido a un coloide de color azul.

Técnica:

En matraz aforado de CIEN MILILITROS (100 ml), colocar DOS MILILITROS (2 ml) de la Tuberculina P.P.D., en control y de la utilizada como referencia, con el fin de que la concentración inicial de CERO CON CINCO POR CIENTO (0,5%) se reduzca a CERO CON CERO UN POR CIENTO (0,01%), para que la coloración posterior que se produzca, pueda ser determinada en la escala habitual de los espectrofotómetros.

Colocar en DOS (2) matraces aforados de CINCUENTA MILILITROS (50 ml), lo siguiente:

Llevar a volumen con agua destilada mezclar e incubar a TREINTA Y SIETE GRADOS CENTIGRADOS (37°C) durante UNA (1) hora.

Leer en espectrofotómetro a SEISCIENTOS OCHO NANOMETROS (608 nm.).

Absorbancia de la muestra x 0,5% =

Absorbancia de la

Tuberculina de referencia

Coloración de las Tuberculinas:

A los efectos de diferenciar visualmente la tuberculina aviar de la bovina, se colorea a la primera con Rojo Ponçeau 2R.

Conservación:

Las tuberculinas P.P.D. deberán conservarse constantemente a una temperatura de CINCO GRADOS CENTIGRADOS MAS MENOS TRES GRADOS CENTIGRADOS (5°C+,-3°C).

Plazo de validez:

Las tuberculinas P.P.D. serán consideradas aptas por un plazo de DOS (2) años.

Cumplidos estos requisitos se otorgará a los laboratorios productores el respectivo certificado de uso y comercialización.