Los conservantes son sustancias auxiliares que se agregan a las preparaciones oficiales para protegerlas de la contaminación microbiana.

Cualquier agente antimicrobiano puede exhibir propiedades conservantes, sin embargo, se debe tener en cuenta que todos los agentes antimicrobianos útiles son sustancias tóxicas. Para evitar efectos adversos, la concentración de los conservantes en el producto terminado debe ser la concentración mínima que presenta el efecto antimicrobiano buscado y considerablemente más baja que la concentración tóxica en seres humanos.

En ningún caso se debe emplear un conservante para prevenir contaminaciones debidas a malas prácticas de elaboración.

Se establecen a continuación los ensayos de Eficacia y Contenido.

Los siguientes ensayos se emplean para demostrar la eficacia de los conservantes agregados a productos sean o no estériles, envasados en envases multidosis. En el caso de productos no estériles, se han agregado para inhibir el crecimiento de microorganismos que hubieran sido introducidos accidentalmente durante o después del proceso de elaboración, mientras que en los productos estériles, ya sean parenterales, óticos, nasales u oftálmicos, deben también inhibir el crecimiento de microorganismos que pudieran introducirse durante las extracciones repetidas de las dosis individuales.

Estos ensayos se aplican solamente al producto en el envase original antes de su empleo.

Microorganismos de ensayo - Emplear cultivos de los siguientes microorganismos [NOTA: pueden emplearse cultivos provenientes de otras colecciones que posean las mismas características]:

Candida albicans (ATCC N° 10231)

Aspergillus niger (ATCC N° 16404)

Escherichia coli (ATCC N° 8739)

Pseudomonas aeuroginosa (ATCC N° 9027)

Staphylococcus aureus (ATCC N° 6538)

Además de los microorganismos mencionados, se pueden incluir otros, especialmente si dichos microorganismos pueden introducirse durante el empleo del producto.

Medios - Para el cultivo inicial de los microorganismos se debe seleccionar un medio que favorezca el crecimiento del respectivo cultivo madre, como por ej., Agar Digerido de Caseína Soja (Ver 90. Control higiénico de productos no obligatoriamente estériles).

Preparación del inóculo - Antes de llevar a cabo el ensayo, inocular superficialmente sendas placas de Petri que contengan un volumen apropiado del medio seleccionado, con cultivos madre recientemente desarrollados de cada uno de los microorganismos especificados.

Incubar los cultivos bacterianos a una temperatura entre 30 y 35°C durante 18 a 24 horas, los cultivos de C. albicans entre 20 y 25°C durante 48 horas y los cultivos de A. niger entre 20 y 25 °C durante 1 semana.

Recolectar los cultivos bacterianos y de C. albicans empleando Solución fisiológica (SR) estéril. Transferir el líquido a un recipiente apropiado y agregar suficiente Solución fisiológica (SR) estéril para reducir la cantidad de microorganismos a 100 millones de microorganismos por ml, aproximadamente. Para recolectar el cultivo de A. niger, emplear Solución fisiológica (SR) estéril que contenga 0,05% de Polisorbato 80 y ajustar el número de esporas a 100 millones por ml aproximadamente, agregando más Solución fisiológica (SR) estéril.

Alternativamente, los microorganismos del cultivo madre pueden desarrollarse en un medio líquido apropiado y las células recolectarse por centrifugación, lavarse y resuspenderse en Solución fisiológica (SR) estéril hasta llegar al número de esporas o microorganismos requerido.

Determinar en cada suspensión el número de unidades formadoras de colonias por ml (ufc/ml), este valor. sirve para determinar el tamaño del inóculo a ser empleado en el ensayo. Si las suspensiones estandarizadas no se emplean en un lapso de tiempo razonable, es necesario controlarlas periódicamente, por el método de recuento en placa, para determinar la viabilidad de los cultivos.

Para el recuento en placa de las preparaciones de ensayo inoculadas, emplear el mismo medio empleado para el cultivo inicial del microorganismo correspondiente. Si hubiera un inactivador específico del agente conservante, agregar una cantidad apropiada del mismo al agar.

Procedimiento - Cuando el envase del producto se presenta con un tapón de goma, que permite acceder al contenido asépticamente por medio de una aguja y una jeringa, llevar a cabo el ensayo en cinco envases originales del producto. Si el envase del producto no permite la extracción aséptica, transferir muestras de 20 ml del producto a cada uno de cinco tubos de ensayo de tamaño apropiado, estériles y cerrados. Inocular cada tubo o envase del producto con cada una de las suspensiones microbianas ya calibradas, en una proporción de 0,10 ml de inóculo por cada 20 ml de producto y mezclar. Se debe agregar una concentración apropiada del microorganismo de ensayo de modo tal que la concentración en la preparación a ensayar, inmediatamente después de la inoculación, sea entre 10⁵ y 10⁶ microorganismos por ml. Determinar el número de microorganismos viables en cada suspensión del inóculo y calcular la concentración inicial de microorganismos por ml del producto en ensayo, por el método de recuento en placa.

Incubar los envases o tubos inoculados a una temperatura entre 20 y 25°C. Examinar los envases o tubos a los 7, 14, 21 y 28 días siguientes a la inoculación. Registrar cualquier cambio de aspecto y determinar, por recuento en placa, el número de microorganismos viables presentes en cada intervalo de tiempo. Calcular el porcentaje de cambio en la concentración de cada microorganismo durante el ensayo, empleando las concentraciones teóricas de los microorganismos presentes al comienzo del ensayo.

Interpretación - El agente conservante resulta eficaz para el producto ensayado cuando: (a) las concentraciones de bacterias viables se reducen a no más de 0,1% de la concentración inicial al día 14, (b) las concentraciones de levaduras y hongos viables permanecen en la concentración inicial o por debajo de la misma durante los primeros 14 días y (c) la concentración de cada microorganismo de ensayo permanece en los niveles indicados o por debajo de los mismos durante los días restantes del período de ensayo.

Los métodos proporcionados aquí se emplean para demostrar que el conservante está presente y su concentración no excede en más de 20% la cantidad declarada.

La concentración de un conservante agregado a una preparación parenteral, ótica, nasal u oftálmica, monodosis o multidosis puede disminuir durante la vida útil del producto. Debido a ésto, el elaborador determinará la menor concentración a la cual el conservante es eficaz. En el momento de su elaboración, el producto debe contener la cantidad declarada de conservante (dentro de ± 20%, admitiendo las variaciones debidas al proceso de elaboración). La afirmación del rótulo en cuanto al contenido del conservante no significa que esa cantidad declarada se mantenga, durante la vida útil del producto, hasta más de 20%.

Los agentes más comúnmente empleados incluyen, los cuatro ésteres homólogos del ácido phidroxibenzoico, fenol, alcohol bencílico, clorobutanol y dos derivados mercuriales, nitrato fenilmercúrico y tiomersal. Para la determinación de los derivados mercuriales se emplean métodos polarográficos, mientras que la cromatografía de gases se emplea en la determinación de los otros agentes.

METODO GENERAL POR CROMATOGRAFIA DE GASES

Los procedimientos generales que se establecen a continuación son aplicables a la determinación cuantitativa del alcohol bencílico, clorobutanol, fenol y los ésteres metílico, etílico, propílico y butílico del ácido p-hidroxibenzoico, tratándose éstos: como un grupo, aunque el método puede emplearse para la determinación individual. Preparar la Solución del estándar interno y la Preparación estándar para cada agente según se indica a continuación para cada caso. A menos que se indique de otro modo, preparar la Preparación muestra con porciones exactamente medidas de la Solución del estándar interno y la muestra, de modo que la concentración del conservante y la composición del solvente sean similares a la concentración y a la composición de la Preparación estándar. Los parámetros operativos sugeridos para el cromatógrafo de gases se indican en la Tabla. Emplear un detector de ionización a la llama y helio o nitrógeno como gas transportador.

Solución del estándar interno - Transferir aproximadamente 380 mg de fenol a un matraz aforado de 200 ml. Disolver en 10 ml de metanol, completar con agua a volumen y mezclar.

Preparación estándar - Transferir aproximadamente 180 mg de alcohol bencílico, exactamente pesados, a un matraz aforado de 100 ml. Disolver en 20,0 ml de metanol, completar a volumen con Solución del estándar interno y mezclar.

Procedimiento - Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales (aproximadamente 5 ml) de la Preparación estándar y la Preparación muestra, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos para el alcohol bencílico y el fenol en el cromatograma de la Preparación estándar, designándolas P₁ y P₂, respectivamente. Del mismo modo, determinar los valores correspondientes p₁ y p₂, para la Preparación muestra. Calcular el contenido de alcohol bencílico (C₇H₈O), en mg por ml, en la muestra, por la fórmula siguiente:

en la cual C es la concentración, en mg por ml, de alcohol bencílico en la Preparación estándar y V es el volumen de muestra, en ml, empleado para preparar 100 ml de la Preparación muestra.

[NOTA: mantener el inyector a 180°C y el detector a 220°C].

Solución del estándar interno - Transferir aproximadamente 140 mg de benzaldehído a un matraz aforado de 100 ml, agregar 10 ml de metanol y agitar hasta disolución. Completar con agua a volumen y mezclar.

Preparación estándar - Transferir aproximadamente 125 mg de clorobutanol, exactamente pesados, a un matraz aforado de 25 ml. Agregar 2 ml de metanol, agitar hasta disolución, completar con agua a volumen y mezclar. Transferir 5,0 ml de esta solución y 5,0 ml de Solución del estándar interno a un matraz aforado de 25 ml y mezclar. La solución así obtenida tiene una concentración conocida de aproximadamente 2,5 mg de clorobutanol por ml.

Preparación muestra - Diluir, si fuera necesario, un volumen exactamente medido de la muestra, cuantitativamente con metanol, hasta obtener una solución que contenga no más de 5,0 mg de clorobutanol por ml. Combinar 3,0 ml de esta solución con 3,0 ml de Solución del estándar interno y mezclar.

Altitud del sistema - (ver 100. Cromatografía) - Cromatografiar la Preparación estándar, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos según se indica en Procedimiento: la resolución, R, entre los picos del benzaldehído y el clorobutanol no es menor de 2,0; los tiempos de retención relativos son aproximadamente 0,8 para el benzaldehído y 1,0 para el clorobutanol y la desviación estándar relativa para inyecciones repetidas no es mayor de 2,0%.

Procedimiento - Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales (aproximadamente 1 ml) de la Preparación estándar y la Preparación muestra, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Calcular la cantidad, en mg, de clorobutanol (C₄H₇Cl₃O) en cada ml de la muestra, por la fórmula siguiente:

en la cual C es la concentración, en mg por ml, de clorobutanol, calculado sobre la sustancia anhidra, en la Preparación estándar, L es la cantidad declarada, en mg, de clorobutanol en cada ml de la muestra, D es la concentración, en mg por ml, de clorobutanol en la Preparación maestra, considerando el volumen de muestra tomado y el grado de dilución y R_M y R_E son los cocientes entre las respuestas de los picos de clorobutanol y benzaldehído obtenidos a partir de la Preparación muestra y la Preparación estándar, respectivamente.

Solución del estándar interno - Transferir 1 ml de alcohol bencílico a un matraz aforado de 500 ml, completar con metanol a volumen y mezclar.

Preparación estándar - Transferir aproximadamente 75 mg de fenol, exactamente pesados, a un matraz aforado de 100 ml, disolver en 7,5 ml de metanol y agregar 20,0 ml de Solución del estándar interno. Completar con agua a volumen y mezclar.

Procedimiento - Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales (aproximadamente 3 ml) de la Preparación estándar y la Preparación muestra, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos de fenol y de alcohol bencílico en el cromatograma de la Preparación estándar, designándolos P₁ y P₂, respectivamente. Del mismo modo, determinar los valores correspondientes a p₁ y p₂, para la Preparación muestra. Calcular el contenido de fenol (C₆H₆O), en mg_ por ml, en la muestra, por la fórmula siguiente:

en la cual C es la concentración, en mg por ml, de fenol en la Preparación estándar y V es el volumen de muestra, en ml, empleado para preparar 100 ml de la Preparación muestra.

Solución del estándar interno - Transferir aproximadamente 200 mg de benzofenona a un matraz aforado de 250 ml, completar a volumen con éter y mezclar.

Preparación estándar- Transferir 100 mg de metilparabeno y 10 mg de propilparabeno, exactamente pesados, a un matraz aforado de 200 ml, diluir a volumen con Solución del estándar interno y mezclar. Transferir 10 ml de esta solución a un erlenmeyer de 25 ml y proceder según se indica para la Preparación muestra, comenzando donde dice "Agregar 3 ml de piridina... ".

Preparación muestra - Transferir 10 ml de muestra y 10 ml de Solución del estándar interno a una ampolla de decantación. Agitar y dejar que las fases se separen. Transferir la fase acuosa a una segunda ampolla de decantación y la fase etérea a un erlenmeyer a través de un embudo que contenga sulfato de sodio anhidro. Extraer la fase acuosa con dos porciones de 10 ml de éter y filtrar los extractos a través de sulfato de sodio anhidro. Evaporar los extractos combinados bajo una corriente de aire seco hasta que el volumen se reduzca a 10 ml aproximadamente. Transferir el residuo obtenido a un erlenmeyer de 25 ml. Agregar 3 ml de piridina, completar la evaporación del éter y calentar a ebullición sobre una placa calefactora hasta que el volumen se reduzca a 1 ml aproximadamente. Enfriar y agregar 1,0 ml de un agente silanizante apropiado, como hexametildisilazano al cual se le ha agregado trimetilclorosilano, bis(trimetilsilil)acetamida, o bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida. Mezclar y dejar reposar durante no menos de 15 minutos.

Procedinúento - Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales (aproximadamente 2 ml) de la solución silanizada de la Preparación estándar y la solución silanizada de la Preparación muestra, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos de metilparabeno, propilparabeno y benzofenona, designándolas P₁, P₂ y P₃, respectivamente. Del mismo modo, determinar los valores correspondientes a p₁, p₂ y p₃, para la solución silanizada de la Preparación muestra. Calcular el contenido, en mg por ml, de metilparabeno (C₈H₈O₃) en la muestra, por la fórmula siguiente:

en la cual C_M, es la concentración, en mg por ml, de metilparabeno en la Preparación estándar y V es el volumen de muestra tomado, en ml. Calcular el contenido, en mg por ml, de propilparabeno (C₁₀H₁₂O₃) en la muestra, por la fórmula siguiente:

en la cual C_p es la concentración, en mg por ml, de propilparabeno en la Preparación estándar. El etilparabeno y el butilparabeno pueden determinarse del mismo modo.

METODO POLAROGRAFICO

Preparación estándar - Transferir aproximadamente 100 mg de nitrato fenilmercúrico, exactamente pesados, a un matraz aforado de 1 litro, disolver en solución de hidróxido de sodio (1 en 250) y calentar, si fuera necesarip. para disolver. Completar a volumen con solución de hidróxido de sodio (1 en 250) y mezclar. Transferir 10 ml de esta solución a un matraz aforado de 25 ml y proceder según se indica en Preparación muestra, comenzando donde dice "agregar 2 ml de solución de nitrato de potasio (1 en 100)... ".

Preparación muestra - Transferir 10 ml de muestra a un matraz aforado de 25 ml, agregar 2 ml de solución de nitrato de potasio (1 en 100) y 10 ml de solución reguladora alcalina de borato pH 9,2 (ver Soluciones reguladoras en Reactivos y Soluciones) y ajustar a pH 9,2, si fuera necesario, con ácido nítrico 2 N. Agregar 1,5 ml de una solución de gelatina (1 en 1000) recientemente preparada, completar a volumen con solución reguladora alcalina de borato pH 9,2 y mezclar.

Procedimiento (ver 700. Polarografia) -Transferir una porción de Preparación muestra a la celda polarográfica y desairear mediante el burbujeo de nitrógeno en la solución durante 15 minutos. Insertar el electrodo capilar de mercurio de un polarógrafo apropiado y registrar el polarograma de -0,6 a -1,5 voltios contra un electrodo de calomel saturado. Determinar la corriente de difusión de la Preparación muestra, (i_d)_D como la diferencia entre la corriente residual y la corriente limitante. En forma similar y en sucesión inmediata determinar la corriente de difusión, (i_d)_E de la Preparación estándar. Calcular la cantidad, en mg, de nitrato fenilmercúrico (C₆H₅HgNO₃) en cada ml de muestra tomada, por la fórmula siguiente:

en la cual C es la concentración, en mg por ml de nitrato fenilmercúrico en la Preparación estándar y los otros términos son los definidos anteriormente.

Preparación estándar- En el día del ensayo, transferir aproximadamente 25 mg de tiomersal, exactamente pesados, a un matraz aforado de 250 ml, completar a volumen con agua y mezclar. [NOTA: proteger esta solución de la luz.] Transferir 15 ml de esta solución a un matraz aforado de 25 ml, agregar 1,5 ml de solución de gelatina (1 en 1000), completar a volumen con solución de nitrato de potasio (1 en 100) y mezclar.

Preparación muestra - Transferir 15 ml de muestra a un matraz aforado de 25 ml, agregar 1,5 ml de solución de gelatina (1 en 1000), completar a volumen con solución de nitrato de potasio (1 en 100) y mezclar.

Procedimiento (ver 700. Polarografía) - Transferir una porción de Preparación muestra a una celda polarográfica y desairear mediante el burbujeo de nitrógeno en la solución durante 15 minutos. Insertar el electrodo capilar de mercurio de un polarógrafo apropiado y registrar el polarograma de -0,2 a -1,4 voltios contra electrodo de calomel saturado. Determinar la corriente de difusión, (i_d)_D como la diferencia entre la corriente residual y la corriente Iimitante. En forma similar y en sucesión inmediata determinar la corriente de difusión (i_d)_E de la Preparación stándar. Calcular la cantidad, en mg, de tiomersal (C₀H₉HgNaO₂S) en cada ml de muestra tomada, por la fórmula siguiente:

en la cual C es la concentración, en mg por ml, de tiomersal en la Preparación estándar y los otros términos son los definidos anteriormente.