Precauciones - Las aflatoxinas son sustancias carcinogénicas. Se debe trabajar bajo campana, evitar la inhalación, el contacto con la piel y en lo posible no abrir los envases originales hada que se realice la disolución.

[NOTA: para descontaminar el material empleado, sumergirlo en solución de hipoclorito de sodio al 2%, dejar actuar durante 18 horas como mínimo, agregar acetona al 5%, dejar actuar durante 30 minutos y lavar con agua].

Este método se emplea para detectar aflatoxinas en drogas vegetales destinadas a la elaboración de infusiones, cocimientos y todos aquellos productos que sufren un tratamiento térmico antes de la administración.

Fase estacionaria - Emplear una placa para cromatografía en capa delgada (ver 100. Cromatografía) recubierta con gel de sílice para cromatografía de 0,25 mm de espesor.

Fase móvil - Cloroformo y acetona (9:1).

Solución reguladora de fosfato pH 7,4 - Transferir 1,0 g de cloruro de potasio, 1,0 g de fosfato monobásico de potasio, 5,8 g de fosfato dibásico de sodio anhidro y 40,0 g de cloruro de sodio a un matraz aforado de 5 litros. Agregar aproximadamente 4,5 litros de agua y disolver.

Ajustar a pH 7,4 empleando ácido clorhídrico o hidróxido de sodio, según sea necesario. Diluir a volumen con agua y ajustar nuevamente el pH.

Soluciones madre del estándar - Disolver el contenido del envase de cada aflatoxina en una mezcla de benceno y acetonitrilo (98:2). Diluir cuantitativamente y en etapas con el mismo solvente hasta obtener soluciones con una concentración de 8 a 10 mg por ml de cada aflatoxina. Agitar vigorosamente la solución durante 1 minuto. Determinar la absorbancia de cada solución a 350 nm, con un espectrofotómetro apropiado, empleando una mezcla de benceno y acetonitrilo (98:2) como blanco. Calcular la concentración de la respectiva aflatoxina, en mg por ml, por la fórmula siguiente:

en la cual P es el peso molecular asignado de la aflatoxina correspondiente y e es la absortividad molar para cada aflatoxina en la mezcla de benceno y acetonitrilo (98:2). Los valores de P y e se encuentran en la Tabla 1.

[NOTA: almacenar las aflatoxinas en el envase original a - 20°C. Las Soluciones madre del estándar de cada aflatoxina deben llevarse a sequedad bajo atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente o en estufa de vacío a 60°C. Preservar las toxinas así obtenidas en un envase con cierre hermético-protegido de la luz a - 20°C. Estas soluciones son estables por 1 año o más].

Tabla 1

Solución estándar - Transferir alícuotas de cada una de las Soluciones madre del estándar valoradas, a un envase de 3 ml de vidrio inactínico, agregar cantidad suficiente de una mezcla de benceno y acetonitrilo (98:2) para preparar una solución que contenga 1 mg por ml de B₁ 0,5 mg por ml de B₂, 1 mg por ml de G₁ y 0,5 mg por ml de G₂.

Columna cromatográfica - Emplear una columna cromatográfica de inmunoafinidad con anticuerpos monoclonales específicos para aflatoxinas.

Solvente de extracción - Disolver 5 g de cloruro de sodio en 200 ml de una mezcla de metanol y agua (70:30).

Solución muestra - Transferir 25 -g de la muestra, previamente molida y tamizada con tamiz N° 20, exactamente pesados, a un erlenmeyer de 500 ml. Agregar cantidad suficiente de Solvente de extracción para que toda la muestra quede embebida. Agitar 1 hora en un agitador mecánico o 5 minutos en licuadora a alta velocidad. Filtrar y recolectar el filtrado en un erlenmeyer de 250 ml. Transferir 80 ml del extracto, exactamente medidos, a un erlenmeyer de 250 ml, agregar 160 ml de Solución reguladora de fosfato pH 7,4. Agitar y filtrar a través de una membrana filtrante de porosidad entre 0,8 y 1,6 mm. Aplicar 120 ml del filtrado (equivalente a 5 g de muestra) a través de la Columna cromatográfrca, asegurando un caudal de 1 ó 2 gotas por segundo y cuidando que la columna no se seque. Lavar la columna con 20 ml de Solución reguladora de fosfato pH 7,4 y secar haciendo pasar aire a través de la misma con una jeringa vacía. Descartar el líquido de lavado. Eluir las aflatoxinas adsorbidas en la columna lentamente por acción de la gravedad con 2 ml de metanol. Recolectar todo el eluido en un balón de 25 ml con un pequeño reservorio en el fondo. Llevar a sequedad en un evaporador rotatorio a 60°C. Disolver el residuo en 100 ml de una mezcla de benceno y acetonitrilo (98:2).

Solución del estándar interno - Mezclar 10 ml de la muestra con 4 ml de la Solución estándar.

Revelador - Solución de ácido sulfúrico al 30 % v/v.

Procedimiento - Aplicar por separado sobre la placa 10 ml de la Solución muestra, 2; 4; y 6 ml de la Solución estándar y 10 ml de la Solución del estándar interno. Dejar secar las aplicaciones y desarrollar los cromatogramas hasta que el frente del solvente haya recorrido aproximadamente 11 cm. Retirar la placa de la cámara y marcar el frente del solvente. Secar la placa al aire protegida de la luz. Examinar la placa bajo luz ultravioleta a 360 mm: las aflatoxinas B₁ y B₂ aparecen como manchas azules y las G₁ y G₂ como manchas verdes. Los valores de R_f son aproximadamente: 0,4 para G₂, 0,5 para G₁, 0,6 para B₂ y 0,7 para B₁. Para confirmar pulverizar sobre la placa con Revelador. Dejar secar a la oscuridad y observar bajo luz ultravioleta a 360 nm: las cuatro aflatoxinas se observan como manchas amarillas. Calcular la concentración de cada aflatoxina, en mg por kg, en la porción de muestra tomada, por la fórmula siguiente:

en la cual P es el volumen, en ml, de Solución estándar sembrado, C es la concentración de aflatoxina en la Solución estándar (B₁ y G₁ 1 mg por ml y B₂ y G₂ 0,5 mg por ml), V es el volumen, en ml, de la dilución final del residuo, S es el volumen de Solución muestra sembrado y m es el peso del residuo en g.

Este método se emplea para determinar aflatoxinas en formas farmacéuticas de uso oral y tópica sin tratamiento térmico antes de la administración.

Sistema cromatográfico - Emplear un equipo para cromatografía de líquidos equipado con un detector de fluorescencia capaz de proveer una excitación de 360 mm y una emisión de 440 mm y una columna 15 cm x 4 mm con fase estacionaria constituida por octadecilsilano químicamente unido a partículas de sílice porosa de 5 mm de diámetro. Mantener la columna a aproximadamente 30°C. El caudal es de aproximadamente 1,0 ml por minuto.

Fase móvil - Agua, acetonitrilo y metanol (40:10:10) filtrado y desgasificado hacer los ajustes necesarios (ver Aptitud del sistema en 100. Cromatografía).

Solución madre del estándar - Proceder según se indica en Método I.

Solución estándar - Transferir alícuotas de cada una de las Soluciones madre del estándar valoradas a matraces apropiados y preparar una solución concentrada que contenga 300 ng por ml de B₁, 50 ng por ml de B₂, 150 ng por ml de G₁ y 50 ng por ml de G₂ empleando una mezcla de benceno y acetonitrilo (98:2). Evaporar a sequedad en estufa de vacío a 60°C y diluir el residuo con 1 ml de acetonitrilo. Transferir las alícuotas indicadas en la Tabla 2 de esta solución a matraces aforados de 10 ml, llevar a volumen con acetonitrilo para obtener las soluciones indicadas en la Tabla 2.

[NOTA: a partir de la Tabla 2 preparar al menos cinco Soluciones estándar diluidas incluyendo una solución estándar diluidas incluyendo una solución cuya concentración represente el límite de detección del sistema cromatográfico empleado].

Columna cromatográfica - Proceder según se especifica en Método I.

Solvente de extracción - Proceder según se especifica en Método I.

Solución de derivatización - Mezclar 10 ml de ácido trifluoroacético con 5 ml de ácido acético glacial y 35 ml de agua bidestilada (este volumen es suficiente para realizar 70 derivatizaciones).

Solución muestra - Transferir 25 g de muestra previamente homogeneizada y molida (tamiz N° 20), exactamente pesados, a un erlenmeyer de 500 ml. Agregar cantidad suficiente de Solvente de extracción para que toda la muestra quede embebida. Agitar 1 hora en un agitador mecánico o 5 minutos en licuadora a alta velocidad. Filtrar y recolectar el filtrado en un erlenmeyer de 250 ml. Transferir 16 ml del extracto a un erlenmeyer de 125 ml, agregar 32 ml de Solución reguladora de fosfato pH 7,4. Agitar y filtrar a través de una membrana filtrante de porosidad de 0,8 a 1,6 mm. Aplicar 24 ml del filtrado a través de la Columna cromatográfica asegurando un caudal de 1 ó 2 gotas por segundo y cuidando que la columna no se seque. Lavar la columna con 20 ml de agua y secar haciendo pasar aire a través de la misma con una jeringa vacía. Descartar el líquido de lavado. Eluir las aflatoxinas adsorbidas en la columna lentamente por acción de la gravedad con 2 ml de metanol. Recolectar todo el eluido en un envase de 5 ml de vidrio inactínico. Llevar a sequedad en estufa de vacío a 55°C. Disolver el extracto con 200 ml de acetonitrilo, agitar vigorosamente y agregar 700 ml de Solución de derivatización. Cerrar el envase y mezclar. Calentar a 65°C durante no menos de 8,5 minutos [NOTA: este tiempo es necesario para una completa derivatización de aflatoxina B₁ (B₂a) y G₁ (G₂a)]. Dejar enfriar a temperatura ambiente antes de abrir el envase.

Procedimiento - Inyectar por separado en el cromatógrafo 50 ml de cada Solucion estándar diluida, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Graficar las respuestas de los picos en función de la concentración de aflatoxinas, en mg por ml, para cada aflatoxina. Trazar la recta que mejor se ajuste a los puntos marcados. Inyectar en el cromatógrafo 50 ml de la Solución muestra, registrar el cromatograma y medir la respuesta de los picos. Los tiempos de retención de las aflatoxinas G₂a, B₂a, G₂ y B₂ son aproximadamente 6, 8 ,9 y 11 a minutos, respectivamente. Calcular la concentración de las aflatoxinas presentes en la Solución muestra empleando el gráfico de respuesta en función de la concentración, obtenido a partir de las Soluciones estándar diluidas.