El ensayo de piretógenos consiste en medir el aumento de la temperatura corporal en el conejo, provocado por la inyección intravenosa de una solución estéril del producto a ensayar.

Materiales y diluyentes - Emplear materiales y diluyentes estériles y libres de piretógenos. Se sugiere el calentamiento a 250°C durante 30 minutos, 200°C durante 1 hora o 180°C durante 3 horas, como método para despirogenar las jeringas de vidrio, agujas y el material de vidrio. Periódicamente se debe verificar ausencia de piretógenos en porciones representativas de los diluyentes y soluciones que se emplean para el lavado y enjuague de dispositivos.

Registro de la temperatura - Emplear un termómetro de mercurio o un dispositivo eléctrico capaz de medir la temperatura con una exactitud de ± 0,1°C y que la lectura máxima se alcance en menos de 5 minutos. Introducir el dispositivo elegido en el recto del conejo a una profundidad no menor de 7,5 cm. El sensor debe permanecer en el recto durante todo el período de registro, se debe inmovilizar al conejo mediante un cepo holgado que le permita adoptar una postura natural. Cuando se emplea un termómetro de mercurio, dejar transcurrir el tiempo necesario (previamente determinado) para que se alcance la temperatura máxima, antes de proceder a la lectura.

Animales para el ensayo - Emplear conejos NZ blancos, adultos, sanos, machos o hembras, cuyo peso no sea menor a 1,5 kg, alimentados con una dieta exenta de antibióticos y que no hayan perdido peso dentro de la semana previa al ensayo.

Alojamiento - Alogar los animales en un ambiente apropiado, a una temperatura uniforme entre 20 y 23°C.

Ensayo preliminar para animales nuevos - Los animales que nunca hayan sido empleados para este ensayo deben someterse a un período de acostumbramiento y control previo. Para ello se colocarán en el cepo 2 horas diarias durante 2 semanas. Durante la segunda semana además se registrará su temperatura a los 60 y 120 minutos de colocados en el cepo. Finalmente se realizará un ensayo con Solución fisiológica libre de piretógenos (SR); no debiendo observarse aumentos de temperatura en cada animal superiores a 0,6°C.

Selección de animales - Pueden emplearse conejos que hayan sido previamente utilizados cuando:

a - ha transcurrido un período mayor de 3 días desde el último ensayo;

b - ha transcurrido un período de por lo menos 14 días en caso que el animal haya presentado un aumento de temperatura de 0,6°C o más durante el ensayo, o ha recibido un producto declarado piretogénico en un ensayo previo.

Procedimiento - Realizar el ensayo sobre un grupo de tres conejos del mismo sexo, en un área con condiciones ambientales similares al espacio donde están alojados habitualmente y que ésta no presente una variación de temperatura mayor a ± 2°C. Los animales serán privados de alimento y agua desde la noche anterior hasta el final del ensayo.

Preparación e inyección de la muestra - La muestra puede disolverse o diluirse en Solución fisiológica (SR) estéril o en el líquido que se especifique en la monografía correspondiente. Calentar la solución a inyectar hasta alcanzar una temperatura de 37 ± 2°C. Inyectar lentamente la solución en la vena marginal de la oreja del conejo durante un tiempo no mayor a 10 minutos a menos que se especifique de otro modo en la monografía correspondiente. El volumen inyectado no debe ser mayor a 10 ml por kg de peso del animal.

Registro de las temperaturas inicial y máxima - La temperatura inicial de cada conejo es la media de dos valores medidos con un intervalo de 30 a 60 minutos previo á la inyección de la muestra: La temperatura máxima es ia temperatura más alta registrada para ese mismo conejo en las 3 horas siguientes a la inyección. Se define la respuesta del animal como la diferencia entre la temperatura máxima y la temperatura inicial de cada conejo. Cuando esta diferencia es negativa el resultado se toma como cero.

Medir la temperatura de cada conejo a intervalos regulares de 30 minutos cono máximo, comenzando por lo menos 90 minutos antes de la inyección de la muestra y durante las 3 horas siguientes. Los conejos que presentan una variación de temperatura mayor a 0,2°C entre dos lecturas sucesivas de las efectuadas para la determinación de la temperatura inicial no deben emplearse. Así como tampoco deben emplearse aquellos conejos cuyas temperaturas iniciales se desvían más de 1°C con respecto a los restantes animales ni aquellos que tengan una temperatura inicial superior a 39,8°C.

Interpretación de los resultados - El producto cumple con los requisitos del ensayo si ningún conejo presenta una respuesta con una variación mayor o igual a 0,5°C. Si uno o más de los tres conejos presenta un aumento de temperatura mayor a 0,5°C se debe repetir el ensayo empleando cinco conejos adicionales. El producto cumple con los requisitos del ensayo si no más de tres de los ocho conejos presentan un aumento de temperatura mayor o igual a 0,5°C y si la suma de los aumentos de temperatura de los ocho conejos no es mayor de 3,3°C.