El siguiente ensayo se emplea para verificar la ausencia de contaminación por microorganismos en productos esterilizados o preparados asépticamente. Durante el desarrollo del ensayo, el área de trabajo no debe estar expuesta a la luz ultravioleta directa ni sometida a otros agentes esterilizantes. Deben realizarse monitoreos microbiológicos del área durante los ensayos.

La ausencia de contaminación microbiana, evidenciada por este procedimiento, confirma que el producto cumple con los requisitos del ensayo aunque el mismo no es suficiente para suponer la total esterilidad del lote ensayado, dadas las limitaciones inherentes a la estadística del muestreo.

Los medios de cultivo se preparan de acuerdo a las siguientes fórmulas. También se pueden emplear fórmulas deshidratadas que luego de reconstituidas cumplan con el Ensayo de promoción del crecimiento.

(Para incubación en condiciones aeróbicas)

Mezclar y calentar hasta disolución completa.

Ajustar el pH del medio con hidróxido de sodio 1 N para obtener, después de la esterilización, un pH de 7,1 ± 0,2. Filtrar en cailente, si fuera necesario, a tráves de un papel de filtro humedecido. Distribuir el medio en recipientes de vidrio que mantenga una relación entre la superficie expuesta y la profundidad de medio tal que no más de la mitad superior experimente un cambio dé color, indicativo de la fijación de oxígeno, al final del período de incubación. Tapar para evitar la contaminación y la evaporación excesiva del medio durante el almacenamiento. Esterilizar en autoclave empleando un procedimiento validado. Enfriar inmediatamente a 25°C. Si más del tercio superior ha tomado una coloración rosada, el medio podrá regenerarse una sola vez, calentando los recipientes en un baño de agua o con vapor fluente, hasta que desaparezca el color. Cuando el medio está listo para emplear, no más del décimo superior debe tener un color-rosado.

*En caso de reemplazarse por Acido tioglicólico emplear 0,3 ml.

(Para incubación en condiciones anaeróbicas)

Disolver los componentes sólidos en el agua, calentando suavemente, si fuera necesario, hasta obtener una solución. Ajustar la solución con hidróxido de sodio 1 N para obtener, después de la esterilización, un pH de 7,1 ± 0,2. Filtrar, si fuera necesario, transferir a recipientes apropiados y esterilizar en autoclave empleando un procedimiento validado. El medio debe ser recientemente preparado o calentado en un baño de vapor y enfriado rápidamente antes de su empleo. No se debe recalentar.

(Para incubación en condiciones aeróbicas)

Disolver los componentes sólidos en el agua, calentando suavemente. Enfriar la solución a temperatura ambiente y ajustar con hidróxido de sodio 1 N para obtener, después de la esterilización, un pH de 7,3 ± 0,2. Filtrar, si fuera necesario, y envasar en recipientes apropiados. Esterilizar en autoclave empleando un procedimiento validado.

Cuando se empleen en el Método de transferencia directa para penicilinas o cefalosporinas, Medio Tioglicolato y Caldo Digerido de Caseína-Soja, transferir en forma aséptica a cada tubo con medio, una cantidad suficiente de penicilinasa para inactivar la cantidad de antibiótico presente en la muestra. Determinar la cantidad apropiada de penicilinasa para este propósito empleando una preparación de penicilinas a, cuya actividad haya sido determinada previamente o confirmar que la cantidad de penicilinasa transferida es la apropiada. Efectuar para ello, el Ensayo de validación para bacteriostasis y funginstasis, empleando menos de 100 unidades formadoras de colonias (ufc) de Staphylococcus aureus (ATCC 29737) y observando desarrollo microbiano típico. [NOTA: en los medios empleados para el método de filtración por membrana, también puede ser necesario el agregado de penicilinasa].

Verificar la esterilidad de cada lote incubando una porción del lote a la temperatura especificada durante 7 días o incubando un recipiente con medio no inoculado como control negativo.

Examinar la carga esterilizada de cada lote de medio para determinar su capacidad de promover el crecimiento microbiano a través de la inoculación, por duplicado, en envases separados de cada medio, con menos de 100 microorganismos viables de cada una de las cepas descriptas en la Tabla 1 e incubando en las condiciones especificadas.

Los medios de cultivo son aceptables si existen evidencias de crecimiento en todos los envases inoculados dentro de los 5 días de incubación. Los ensayos pueden ser llevados a cabo simultáneamente con los ensayos de esterilidad. El ensayo de esterilidad no es válido si el medio de cultivo presenta una respuesta inapropiada al crecimiento microbiano.

Si los medios recientemente preparados no se emplean en el término de 2 días, se deben almacenar entre 2 y 25°C.

Si los medios se almacenan en envases sellados pueden ser empleados durante no más de 1 año, pero se deben llevar a cabo los ensayos de promoción del crecimiento cada 3 meses y confirmar si cumplen con los requisitos correspondientes al color del indicador.

Solución A - Disolver 1 g de digerido péptico de tejido animal en agua hasta obtener 1 litro, filtrar o centrifugar para obtener una solución transparente. Ajustar a pH 7,1 ± 0,2, envasar en recipientes apropiados y esterilizar. [NOTA: cuando la Solución A deba ser empleada para realizar el ensayo de esterilidad de una muestra de antibióticos del tipo penicilina o cefalosporina, agregar asépticamente una cantidad de penicilinasa estéril a la Solución A, suficiente para inactivar el antibiótico residual en las membranas después que la solución muestra haya sido filtrada].

Solución D - Agregar 1 ml de polisorbato 80 por cada litro, de Solución A cuando la muestra contiene lecitina o aceite o en los ensayos para determinar la esterilidad de las partes internas de dispositivos estériles por filtración a través de meriibrána. Ajustar a pH 7,1± 0,2. Transferir a los envases y esterilizar.

Distribuir en recipientes apropiados y esterilizar.

[NOTA: la solución de lavado y dilución empleada, no deberá tener propiedades antibacterianas o antifúngicas. Esto se comprueba efectuando el Ensayo de validación para bacteriostasis y fungistasis.]

Antes de efectuar un ensayo de esterilidad de un producto dado, se determinará el nivel de actividad bacteriostática y fungistática del mismo a través de los procedimientos que se describen a continuación. Estos procedimientos se efectúan al menos cada vez que se cambia alguna condición del ensayo o la composición del producto.

Preparar cultivos diluidos de bacterias y hongos de al menos los microorganismos indicados en la Tabla 1 e incubando en las condiciones especificadas, para obtener una concentración final de cada uno de los microorganismos empleados menor a 100 ufc por ml.

Filtrar la cantidad de muestra a emplear para realizar el ensayo de esterilidad. Lavar la membrana, si fuera necesario, con tres porciones de 100 ml de la Solución de lavado y dilución apropiada, inoculando el lavado final con menos de 100 ufc. Repetir el lavado en otro filtro en el que no hubo pasaje de muestra (control positivo). Colocar la membrana o la mitad de la membrana en 100 ml del medio de cultivo especificado o agregar el medio especificado al embudo que contiene la membrana. Repetir el procedimiento para los microorganismos y los medios especificados en la Tabla 1 e incubar los envases a la temperatura apropiada y bajo las condiciones señaladas, por un período no menor a 7 días.

Si el crecimiento de los microorganismos en la mezcla de producto y medio de cultivo fuera visualmente comparable al observado en los frascos del control positivo, se debe emplear la misma cantidad de producto y de medio de cultivo cuando se realice el ensayo de esterilidad.

Si el desarrollo microbiano del medio de cultivo con producto no es visualmente comparable al observado en el control positivo, el producto posee propiedades bacteriotáticas y/o fungistáticas. Repetir aumentando el número de lavados, cambiando el tipo de membrana, o empleando un agente neutralizante. Si no se logró neutralizar el residuo antimicrobiano de la membrana aún con 5 lavados de 500 ml cada uno, proceder con el ensayo de esterilidad.

Inocular dos recipientes de cada medio de cultivo con menos de 100 ufc de los microorganismos especificados en la Tabla 1, empleando los volúmenes de cada medio especificados en la Tabla 2. Agregar la cantidad de muestra especificada a uno de los recipientes. El otro será el control positivo. Repetir el procedimiento para cada cepa e incubar durante no más de 7 días.

Si el crecimiento de los microorganismos en la mezcla de producto y medio de cultivo fuera visualmente comparable al observado en los frascos de control positivo, se emplea la misma cantidad de producto y de medio de cultivo cuando se efectúa el ensayo de esterilidad.

Si el desarrollo microbiano del medio de cultivo con producto no es visualmente comparable al observado en el control positivo, el producto posee propiedades bacteriostáticas y/o fungistáticas. Repetir el ensayo empleando agentes neutralizantes estériles, como polisorbato 80, lecitina o penicilinasa, o incrementar el volumen de medio. Emplear la menor cantidad de volumen de medio para no afectar el crecimiento de microorganismos en presencia del producto a ensayar. Si se incrementó el volumen del medio para no afectar el crecimiento de microorganismos en presencia del producto a ensayar. Si se incrementó el volumen del medio a 2 litros y aún posee propiedades antimicrobianas, proceder con el ensayo de esterilidad.

El ensayo puede realizarse de dos maneras: por transferencia directa al medio o mediante el método de filtración por membrana. A menos que se especifique de otro modo en la monografía correspondiente, emplear el método de filtración por membrana.

Limpiar la superficie exterior de las ampollas, los tapones de viales y frascos con un agente descontaminante apropiado y acceder al contenido de los mismos en forma aséptica. Si el contenido de los viales fuera envasado al vacío, se debe introducir en ellos aire estéril por medio de un dispositivo estéril a la que se adosa un filtro esterilizante.

Los envases de algodón purificado, gasas, apósitos quirúrgicos, suturas y materiales similares, deben abrirse mediante técnicas asépticas.

Cuando se emplea el método de Filtración por membrana, a menos que se especifique de otro modo en este capítulo o en la monografía y correspondiente, emplear, en lo posible, el contenido total de cada unidad, pero no menos de las cantidades especificadas en las Tablas 2 y 3. Cuando se emplee el método de Transferencia directa, emplear las cantidades indicadas en las Tablas 2 y 3. Si el contenido de las unidades fuera suficiente, se puede dividir para agregar a cada uno de los dos medios especificados para el ensayo. Si cada unidad no tuviera un contenido suficiente para ambos medios, emplear el doble de unidades.

A menos que se especifique de otro modo en la monografía correspondiente o en una sección de este capítulo, incubar la mezcla de ensayo durante 14 días con Medio Tioglicolato o Caldo Tioglicolato Alternativo a una temperatura de 32,5 ±2,5°C y con Caldo Digerido de Caseína-Soja a una temperatura de 22,5 ± 2,5°C, empleando volúmenes de medio no menores a los indicados en las Tablas 2 y 3.

Membrana - Una membrana apropiada para los ensayos de esterilidad posee un tamaño de poro de 0,45 µm y un diámetro aproximado de 47 mm y tiene un borde hidrofóbico o de baja retención de producto para minimizar la inhibición microbiana de los residuos. Si el producto no tiene sustancias inhibidoras puede emplearse una membrana sin borde hidrofóbico, pero debe humedecerse antes de agregar la solución con el producto. La membrana puede esterilizarse por separado, por cualquier método que conserve sus características de filtración. Cuando el producto a ser ensayado es un aceite, la membrana debe estar completamente seca antes de realizar el ensayo.

Membrana filtrante - Es un dispositivo que posibilita la manipulación aséptica de las muestras a ensayar, permitiendo la remoción aséptica de la membrana y su incorporación al medio de cultivo o un sistema dondé el medio pueda ser agregado y la membrana incubada in situ. El dispositivo puede ser montado y esterilizado con la membrana colocada antes de su empleo.

Líquidos miscibles en vehículos acuosos - Transferir asépticamente los volúmenes requeridos para ambos medios, según se indica en la Tabla 2. Filtrar inmediatamente con la ayuda de vacío o presión.

Si los líquidos son viscosos y difíciles de filtrar, se pueden emplear más de dos dispositivos, se incuba en cada medio la mitad del número de membranas empleadas, cuidando que los volúmenes y el número de envases se ajusten a las condiciones especificadas. Si el producto tiene propiedades bacteriostáticas o fungistáticas, lavar la membrana o membranas con tres porciones de 100 ml de Solución A.

Retirar asépticamente la membrana o membranas de sus respectivos dispositivos (si se emplea una sola membrana cortarla por la mitad). Sumergir cada mitad o cada membrana entera, según corresponda, en los medios de cultivo correspondientes e incubar. Si se emplea un sistema cerrado, llenar cada recipiente con el medio correspondiente cuidando que este procedimiento no cause excesiva alteración del Medio tioglicolato.

Líquidos inmiscibles en vehículos acuosos - Transferir asépticamente el volumen requerido para ambos medios de cultivo según se indica en la Tabla 2. De este modo, la membrana representa el contenido de los veinte envases filtrados. Puede incubarse media membrana en cada medio. Filtrar inmediatamente con ayuda de vacío o presión.

Si la muestra es un líquido viscoso o una suspensión que no se adapta a la filtración rápida, agregar asépticamente el diluyente al líquido recolectado de todos los envases para aumentar la velocidad de filtración. Si la muestra a ensayar tiene propiedades bacteriostáticas o fungistáticas o posee algún conservador, lavar el filtro de 1 a 3 veces con 100 ml de Solución A. Si el producto contiene lecitina, reemplazar la Solución A por Solución D. Al finalizar la filtración y el lavado, proceder con la membrana o membranas según se indica en Líquidos miscibles en vehículos acuosos, comenzando donde dice "Retirar asépticamente la mebrana...".

Sólidos filtrables - Transferir una cantidad del producto sólido (una solución o suspensión del producto reconstituido) correspondiente a la cantidad indicada en la Tabla 3. A menos que se especifique de otro modo en la monografía correspondiente, el número de unidades a ensayar es el mismo especificado en Líquidos miscibles en vehículos acuosos. Transferir la muestra en forma aséptica a un recipiente que contenga 200 ml de Solución. A y agitar hasta disolución.

Si la muestra no se disuelve totalmente, emplear 400 ml de la Solución A o dividirla en 2 porciones iguales y disolver cada una en 200 ml de Solución A. Transferir asépticamente la solución o soluciones a uno o dos sistemas filtrantes y filtrar con la ayuda de vacío o presión.

Proceder según se indica en Líquidos miscibles en vehículos acuosos comenzando donde dice "Si el producto tiene propiedades bacteriostáticas...".

Formas semisólidas y aceites solubles en miristato de isopropilo - Disolver la cantidad de cada unidad especificada en la Tabla 3 en no menos de 100 ml de miristato de isopropilo cuyo extracto acuoso posee un pH no menor a 6,5 (ver Especificaciones de reactivos en Reactivos y Soluciones) el cual se ha esterilizado previamente empleando una membrana de 0,22 µm de porosidad. [NOTA: calentar el solvente esterilizado y, si fuera necesario, la muestra a ensayar a no más de 44°C antes de ser empleado]. Agitar el frasco para disolver la muestra. Transferir en forma aséptica a uno o dos sistemas filtrantes y filtrar con ayuda de vacío o presión. Mantener la membrana filtrante cubierta-con líquido para una máxima eficiencia de filtración. Lavar la/s membrana/s con dos alícuotas de 200 ml de Solución D; posteriormente con 100 ml de Solución A. Proceder según se indica en Líquidos miscibles en vehículos acuosos comenzando donde dice "Retirar asépticamente la membrana..." agregando 1 g de polisorbato 80 por litro de medio de cultivo empleado.

Si la muestra a ensayar contiene vaselina, emplear Solución K. Humedecer la/s membranas con aproximadamente 200 µl de solución de lavado antes de comenzar la filtración y mantener la/s membrana/s cubierta/s con líquido durante el filtrado para obtener la máxima eficiencia en la filtración. Posteriormente lavar las membranas con tres alícuotas de 100 ml de Solución K. Proceder según se indicó anteriormente.

Inyectables sólidos - Disolver o suspender el polvo como se indica en el rótulo y proceder según se indica en Líquidos miscibles en vehículos acuosos.

Aerosoles estériles - Colocar las unidades de aerosoles líquidos en una mezcla de alcohol y hielo seco a una temperatura no mayor de -20°C durante aproximadamente 1 hora. Dejar escapar el propelente, si es posible; antes de abrir asépticamente las unidades y transferir el contenido a un frasco estéril. Agregar 100 ml de Solución D y mezclar suavemente. Proceder según se indica en Líquidos miscibles en vehículos acuosos o Líquidos inmiscibles en vehículos acuosos según corresponda.

Dispositivos médicos esterilizados - Los dispositivos que tienen pasos o conductos estériles se ensayan según se describe a continuación. Transferir asépticamente a través de cada dispositivo diez veces un volumen suficiente de Solución D, de modo de recuperar no menos de 100 ml de cada dispositivo. Recoger la solución en recipientes estériles y filtrar el total del volumen recogido a través de embudo/s con membrana filtrante, según se indica en Líquidos miscibles en vehículos acuosos, comenzando donde dice "Retirar asépticamente la membrana...".

Jeringas prellenadas - Drenar el contenido de cada jeringa a través de la aguja o directamente si no tiene la aguja colocada. Proceder según se indica en Líquidos miscibles en vehículos acuosos.

Líquidos no filtrables - Transferir asépticamente, a partir de los envases originales, el volumen de muestra especificado, empleando pipetas o jeringas con agujas estériles, a un frasco con medio de cultivo. Mezclar el líquido con el medio sin airear excesivamente. Proceder según se indica en Procedimiento.

Formas semisólidas y aceites insolubles en miristato de isopropilo - Dividir los envases en dos grupos de diez para llevar a cabo el siguiente procedimiento con cada uno de ellos. En forma aséptica, transferir de cada uno de los envases la cantidad indicada en la Tabla 3, a un recipiente con 200 ml de un vehículo acuoso estéril capaz de dispersar homogéneamente el producto a ensayar. [NOTA: la elección del dispersante incorporado al vehículo acuoso depende de la naturaleza del producto]. Antes de iniciar el ensayo con un dispersante, determinar que, a la concentración empleada, no posea efectos antimicrobianos, empleando los procedimientos establecidos en Ensayo de validación para bacteriostasis y fungistasis. Mezclar una alícuota de 20 ml de la muestra dispersada con 200 ml de cada medio de cultivo y proceder según se indica en Procedimiento.

Sólidos no filtrables - Transferir una cantidad del producto sólido (una solución o suspensión del producto reconstituido) correspondiente a no menos de la cantidad indicada en la Tabla 3, a un recipiente que contenga no menos de 200 ml de Medio Tioglicolato y mezclar. Repetir el procedimiento con la misma cantidad de Caldo Digerido de Caseína-Soja y mezclar. Proceder según se indica en Procedimiento.

Algodón purificado, gasa, apósitos quirúrgicos, material para suturas y productos relacionados -De cada envase de algodón, gasa en rollos o vendas de gasa, extraer en forma aséptica dos o más porciones de 100 a 500 mg de la parte más interna del envase. En el caso de materiales envueltos individualmente, extraer asépticamente una sola porción de 250 a 500 mg o la muestra entera en el caso de productos pequeños.

Transferir asépticamente estas porciones al número especificado de recipientes con medio de cultivo. Incubar. Proceder según se indica en Procedimiento.

Dispositivos médicos esterilizados - Para dispositivos, que por su tamaño y forma, permitan la completa inmersión en el medio de cultivo, puede emplearse el método de transferencia directa sumergiendo el dispositivo completo en el medio apropiado siempre que el lumen o el interior del material quede lleno con medio. Incubar y proceder según se indica en Procedimiento.

Para guías de transfusión o perfusión o cuando el tamaño de la muestra hace impracticable su inmersión y si sólo la cara interna del tubo debe ser estéril, lavar los lúmenes de veinte unidades con una cantidad suficiente de Medio Tioglicolato y el lumen de veinte unidades con una cantidad suficiente de Medio Digerido de Caseína-Soja para obtener no menos de 15 ml de cada medio. Para instrumentos en los cuales el lumen es demasiado pequeño como para permitir el paso del Medio Tiogliocolato, se lo debe sustituir por el Caldo Tigliocolato Alternativo siempre que el medio se emplee en condiciones anaeróbicas.

Cuando a causa del tamaño y forma de un dispositivo no pueda llevarse a cabo el ensayo de esterilidad por inmersión, sumergir en los medios de cultivo las partes que estarán en contacto con el paciente. Para catéteres en los que es requisito de esterilidad tanto su interior como su exterior, cortarlos en porciones tales que el medio se encuentre en contacto con todo el dispositivo.

Cuando la muestra en el medio interfiera con el ensayo debido a su acción bacteriostática o fungistática, proceder según se indica en Método de filtración por membrana.

Examinar el medio visualmente para comprobar si hay crecimiento microbiano al tercer, cuarto o quinto día; al séptimo u octavo y el último día del período del ensayo.

Cuando el material ensayado produce turbidez en el medio y la observación visual del crecimiento de bacterias u hongos es dificultosa, transferir porciones apropiadas de la mezcla que contiene la muestra y el medio a envases con medio de cultivo nuevo, durante el período del tercer al séptimo día después de haber empezado el ensayo. Se debe continuar con la incubación de varias muestras, la inicial y la de transferencia por no menos de 14 días desde la incubación inicial.

En zonas limpias y en áreas limpias - En los intervalos indicados durante y al final del período de incubación, se debe observar el contenido de todos los recipientes empleados para la detección de desarrollo microbiano. Si no se observa desarrollo, el producto cumple con los requisitos del ensayo de esterilidad.

Si se observa desarrollo microbiano, pero si los monitoreos de las instalaciones donde se lleva a cabo el ensayo, de los materiales empleados, la técnica empleada y los controles negativos indican que el procedimiento fue inapropiado, el ensayo se declara nulo y debe repetirse. Si se observa desarrollo microbiano confirmado microscópicamente y no existen evidencias suficientes para anular el ensayo, el producto no cumple con los requisitos del ensayo de esterilidad.

En aisladores - Cuando el ensayo de esterilidad se realiza en aislador, el producto cumple con los requisitos del ensayo de esterilidad cuando no se observa desarrollo microbiano. Cuando se observa desarrollo microbiano y es confirmado microscópicamente, el producto no cumple con los requisitos del ensayo de esterilidad. El ensayo no se considera válido cuando se demuestra pérdida de integridad física del aislador, por falla en la técnica aséptica o por materiales no estériles dentro del aislador. En estos casos se debe repetir el ensayo.