Estos ensayos están diseñados para determinar la reactividad biológica de materiales elastoméricos, plásticos y otros polímeros destinados a estar en contacto directo o indirecto con pacientes. Pueden realizarse in vitro o in vivo.

Para los objetivos establecidos en este capítulo se aplican las siguientes definiciones: la muestra es el material o un extracto preparado a partir del mismo; el blanco consiste en la misma cantidad del mismo medio empleado en la extracción de la muestra, tratado de la misma forma que el medio que contiene la muestra a ensayar; el control negativo es un material que produce una reactividad reproducible y despreciable en las condiciones del ensayo y el control positivo es un material que produce una reactividad reproducible y de citotoxicidad moderada en las condiciones del ensayo, como por ej., latex de goma.

Los materiales poliméricos deben ensayarse en las condiciones en que van a ser empleados. Si los materiales van a ser sometidos a procedimientos de limpieza y/o esterilización, la muestra debe ser preparada con material preacondicionado del mismo modo.

Estos ensayos evalúan la reactividad biológica de cultivos de células de mamíferos después del contacto con materiales elastoméricos, plásticos y otros polímeros o de extractos específicos preparados a partir de los mismos.

Se describen tres ensayos: el Ensayo de Difusión en Agarosa, el Ensayo de Contacto Directo y el Ensayo de Elución. La elección del tipo o número de ensayos a emplear para la evaluación de la respuesta biológica de una determinada muestra o extracto depende del material empleado, del producto final y del uso posterior.

Preparación del cultivo celular – Preparar múltiples cultivos de la línea celular L929 (tejido conectivo de ratón, monocapa epitelial) en medio de cultivo Dulbecco’s modified Eagles Medium (DMEN) suplementado con suero fetal bovino al 10%, glutamina 0,3%, aminoácidos no esenciales 1%, con una densidad de sembrado de 4.105 células por ml. Incubar a 37 ± 1 °C en una estufa de cultivo en atmósfera humedificada de 5 ± 1% de dióxido de carbono en aire durante 24 horas hasta que la monocapa alcance una confluencia mayor al 80%. Examinar los cultivos preparados con un microscopio invertido para asegurar monocapas uniformes casi confluentes.

[NOTA: la reproducibilidad de los ensayos de reactividad biológica in vitro depende de la obtención de una densidad de cultivo uniforme.]

Solventes de extracción - Emplear Solución fisiológica (SR) estéril. Pueden emplearse también medios de cultivo para células de mamífero sin suero o medios de cultivo de células de mamífero suplementados con suero cuando la extracción se realiza a 37°C durante 24 horas.

Aparatos - Emplear un autoclave; una estufa, preferiblemente de convección forzada, que mantenga las temperaturas de operación entre 50 y 70 ± 2°C; una estufa de cultivo, capaz de mantener una temperatura de 37 ± 1°C y una atmósfera humidificada de 5 ± 1% de dióxido de carbono en aire.

Materiales –

Envases de extracción - Emplear envases con tapa a rosca de vidrio Tipo I. Si la tapa a rosca contiene una cubierta interna elastomérica, ésta debe estar totalmente protegida con material inerte de 50 a 75 µm de espesor.

Preparación del material - Limpiar cuidadosamente todo el material de vidrio con mezcla sulfocrómica y, si fuera necesario, con ácido nítrico caliente seguido de lavados con Agua para Inyectables. Esterilizar y secar los envases e instrumental empleados para la extracción, transferencia o administración del material de ensayo.

Procedimiento -

Preparación muestra - Seleccionar y subdividir la muestra según se indica en la Tabla 1.

Es esencial la relación entre la superficie expuesta a la extracción y el volumen de solvente de extracción. Cuando la superficie de la muestra no pueda ser determinada emplear 0,1 g de elastómero ó 0,2 g de material plástico u otro material por cada ml de medio de extracción.

Transferir la muestra subdividida a una probeta graduada, estéril, de vidrio Tipo I de 100 ml, provista de un tapón de vidrio. Lavar dos veces con aproximadamente 70 ml de Agua para Inyectables, agitando durante 30 segundos en cada lavado y eliminando completamente el agua de lavado. Secar las piezas destinadas a la extracción con Aceite Vegetal, en estufa que no exceda los 50 °C. [NOTA: la muestra no se debe limpiar con paño húmedo o seco, ni lavar o enjuagar con solventes orgánicos, detergentes, etc.]. Se deben tomar precauciones para evitar la contaminación con microorganismos u otros materiales extraños.

Preparación de extractos - Transferir al envase de extracción 20 ml de Solución fisiológica (SR) estéril o medio de cultivo para células de mamífero sin suero como solvente de extracción y agregar las piezas de la muestra individualmente. Repetir este procedimiento para cada medio de extracción requerido en el ensayo. Preparar un blanco con 20 ml de cada medio de extracción. Realizar la extracción por calentamiento en autoclave a 121 °C durante 60 minutos o en estufa a 70 °C durante 24 horas o a 50 °C durante 72 horas. [NOTA: si la extracción se realiza a 37 °C durante 24 horas, en estufa de cultivo, emplear el medio de cultivo celular suplementado con suero.]

[NOTA: las condiciones de extracción no deben causar alteraciones físicas como fusión o aglomeración de los trozos del material plástico, pues esto provocaría una reducción del área expuesta; sólo es aceptable una leve adherencia del material. Siempre agregar las piezas limpias individualmente al medio de extracción.]

Enfriar a temperatura ambiente, pero no menor de 20 °C. Agitar vigorosamente durante algunos minutos y transferir, inmediatamente en forma aséptica, cada extracto a un recipiente seco y estéril. Almacenar los extractos a temperatura entre 20 y 30 °C y emplearlos dentro de las 24 horas.

Este ensayo se emplea para evaluar materiales poliméricos o sus respectivos extractos. En este ensayo la capa de agarosa protege a la monocapa celular de un eventual daño mecánico, al mismo tiempo que permite la difusión de productos químicos cedidos por la muestra. Cuando se analizan extractos, éstos se aplican sobre una porción de papel de filtro atóxico.

Preparación muestra - Emplear porciones de la muestra que tengan una superficie plana no menor de 100 mm2 o preparar extractos según se indica en Preparación de extractos y aplicar 50 µl del extractivo sobre papel de filtro de superficie no menor de 100 mm2.

Preparación de controles positivos y negativos - Proceder según se indica en Preparación muestra.

Procedimiento - Preparar monocapas en placas de cultivo de 35 mm de diámetro, sembrando 2 ml de la suspensión -celular según se indica en Preparación del cultivo celular. Luego de la incubación aspirar el medio de cultivo y reemplazarlo con un medio preparado mezclando partes iguales del medio de cultivo y de agarosa al 0,7 %.

Transferir la muestra, el control positivo y el control negativo, o sus respectivos extractos, por duplicado, en contacto con la superficie de la agarosa solidificada de diferentes placas. Incubar todas las placas durante 24 horas a 37 ± 1 °C, en la estufa de cultivo. Fijar, remover la capa de agarosa y teñir con un colorante citoquímico. Examinar en cada cultivo la reactividad alrededor de la muestra, del control positivo y del control negativo.

Interpretación de los resultados – La reactividad biológica (degeneración y malformación celular) se describe y se califica en una escala de 0 a 4 (ver Tabla 2). Medir las respuestas obtenidas con el control negativo, el control positivo y la muestra. El ensayo es válido si la respuesta observada con el control negativo es grado 0 (ninguna reactividad) y para el control positivo no es menor que grado 3 (reactividad moderada). La muestra cumple con los requisitos del ensayo si la respuesta observada no es mayor de grado 2 (reactividad leve). Repetir el ensayo si no se confirma su validez.

Este ensayo se emplea para evaluar materiales poliméricos. El procedimiento permite la extracción y ensayo simultáneo de los componentes químicos extraídos desde la muestra con un medio suplementado con suero. Este ensayo no es apropiado para materiales de muy baja densidad ni alta densidad que puedan causar daño mecánico a las células.

Preparación muestra – Emplear porciones de muestra que tengan superficies planas no menores de 100 mm2.

Preparación de controles positivos y negativos – Proceder según se indica en Preparación muestra.

Procedimiento – Preparar monocapas en placas de cultivo de 35 mm de diámetro empleando 2 ml de la suspensión de células preparadas según se indica en Preparación del cultivo celular. Luego de la incubación, aspirar el sobrenadante del medio de cultivo y reemplazarlo con 0,8 ml de medio de cultivo fresco. Colocar en diferentes placas de cultivo la muestra, el control positivo y el control negativo, todos por duplicado. Incubar todas las placas durante 24 horas a 37 ± 1 °C, en estufa de cultivo. Fijar, lavar y teñir con un colorante citoquímico. Examinar en cada cultivo la reactividad alrededor de la muestra, del control positivo y del control negativo.

Interpretación de los resultados – Proceder según se indica para Interpretación de los Resultados en Ensayo de Difusión en Agarosa. La muestra cumple con los requisitos del ensayo si la respuesta observada no es mayor que grado 2 (reactividad leve). Repetir el ensayo si no se confirma su validez.

Este ensayo se emplea para evaluar extractos de materiales poliméricos. El procedimiento permite la extracción de la muestra a temperatura fisiológica o no fisiológica, variando los intervalos de tiempo. Es apropiado para materiales de alta densidad y para evaluaciones dosis-respuesta.

Preparación muestra – Proceder según se indica en Preparación de los extractos. Alternativamente, emplear medio de cultivo de células de mamífero suplementado con suero como medio de extracción para simular las condiciones fisiológicas. Preparar los extractos incubando 24 horas en estufa de cultivo para evitar la desnaturalización de las proteínas del suero.

Preparación de los controles positivos y negativos – Proceder según se indica en Preparación muestra.

Procedimiento – Preparar las monocapas en placas de 35 mm de diámetro empleando 2 ml de suspensión de células, preparada según se indica en la Preparación del cultivo celular. Luego de la incubación, aspirar el medio de cultivo de las monocapas y reemplazarlo con los extractos de la muestra, del control positivo y del control negativo. Los extractos con medio de cultivo con y sin suero se ensayan por duplicado sin dilución. El extracto preparado con Solución fisiológica (SR) estéril se diluye con medio de cultivo suplementado con suero hasta una concentración del 25 % del extracto y se realiza el ensayo por duplicado. Incubar todas las placas durante 48 horas a 37 ± 1 °C, con estufa de cultivo. Fijar, lavar y teñir con un colorante citoquímico. Examinar en cada cultivo la reactividad de la monocapa celular bajo microscopio.

Interpretación de los resultados – Proceder según se indica para Interpretación de los Resultados en Ensayo de Difusión en Agarosa pero empleando la Tabla 3. La muestra cumple con los requisitos del ensayo si la respuesta observada no es mayor que grado 2 (reactividad media). Repetir el ensayo si no se confirma su validez. Para evaluaciones dosis-respuestas, repetir el procedimiento, empleando diluciones cuantitativas de los extractos.

Estos ensayos evalúan la respuesta biológica de animales frente a materiales elastoméricos, plásticos y otros polímeros o de extractos específicos preparados a partir de los mismos.

Se describen tres ensayos: el Ensayo de Inyección Sistémica, el Ensayo Intracutáneo y el Ensayo de Implantación.

El Ensayo de Inyección Sistémica y el Ensayo Intracutáneo se emplean para evaluar la respuesta sistémica y local respectivamente, luego de la inyección de una sola dosis de extractos específicos del material a ensayar. El Ensayo de Implantación evalúa la reacción del tejido vivo luego de la implantación del material como tal.

El Ensayo de Inyección Sistémica y el Ensayo Intracutáneo se aplican a materiales elastoméricos, especialmente cierres elastoméricos, con significativa reactividad positiva en el Ensayo de Reactividad Biológica in vitro.

Estos tres ensayos se emplean también para evaluar materiales destinados a la fabricación de envases y otros accesorios para uso en preparaciones parenterales y para uso en dispositivos biomédicos e implantes.

Sustancia de referencia - Polietileno de alta densidad SR-FA (control negativo).

Medios de extracción –

Solución fisiológica (SR) estéril.

Solución de alcohol en Solución fisiológica (SR) estéril (1 en 20).

Polietilenglicol 400.

Aceite Vegetal - Aceite de sésamo (preferentemente recién refinado) u otro aceite vegetal apropiado.

Vehículo de la droga (cuando corresponda).

Agua para Inyectables.

[NOTA: el Aceite de sésamo u otro aceite vegetal debe cumplir con el siguiente requisito: Obtener el aceite, si es posible recién refinado. Emplear tres animales e inyectarles el aceite por vía intracutánea en una dosis de 0,2 ml en diez sitios diferentes por animal y observarlos a las 24, 48 y 72 horas posteriores a la inyección. Calificar la reacción en cada sitio según se indica en la Tabla 4. Para tres conejos (treinta sitios de inyección), en cualquier período de observación, la respuesta promedio eritematosa no debe ser mayor de 0,5 y la repuesta promedio edematosa no debe ser mayor de 1,0 y ningún sitio de inyección debe presentar una reacción de diámetro mayor que 10 mm. El residuo de aceite en el sitio de inyección no debe mal interpretarse como edema. El tejido edematoso se blanquea cuando se presiona suavemente.]

Aparatos - Emplear un autoclave y una estufa, preferentemente de convección forzada, que mantenga las temperaturas entre 50 y 70 ± 2 °C.

Materiales - Proceder según se indica en Materiales en Ensayo de reactividad biológica in vitro.

[NOTA: limpiar el instrumental para cortar la muestra por un método apropiado (por ej., sucesivas limpiezas con acetona y cloruro de metileno), antes de subdividir el material.]

Procedimiento –

Preparación muestra - Proceder según se indica para Preparación muestra en Ensayos de reactividad biológica in vitro. El Ensayo de Inyección Sistémica y el Ensayo Intracutáneo se llevan a cabo empleando el mismo extracto o, si se prefiere, se preparan extractos individuales para cada ensayo.

Preparación de extractos - Proceder según se indica para Preparación de extractos en Ensayos de reactividad biológica in vitro pero empleando un medio de extracción apropiado.

Este ensayo se emplea para evaluar la respuesta sistémica a los extractos de los materiales bajo ensayo, luego de la inyección a ratones.

Animales - Emplear ratones albinos sanos, no empleados en ensayos anteriores, que pesen entre 17 y 23 g. Para cada grupo emplear ratones de un mismo origen. Proveer agua y alimento ad libitum.

Procedimiento - [NOTA: agitar cada extracto vigorosamente antes de extraer la dosis a inyectar, asegurando una perfecta homogeneización del extracto]. Tratar un grupo de cinco ratones con la muestra o el blanco según se indica en la Tabla 5, pero diluir cada gramo de muestra preparada con polietilenglicol 400 y su correspondiente blanco con 4,1 volúmenes de Solución fisiológica (SR) estéril, hasta obtener una solución que contenga aproximadamente 200 mg de polietilenglicol 400 por ml.

Interpretación de los resultados - Luego de la inoculación, observar los animales a las 4, 24, 48 y 72 horas. La muestra cumple con los requisitos del ensayo si, durante el período de observación, ninguno de los animales inoculados con la muestra presenta un grado de reactividad biológica significativamente mayor que los animales inoculados con el blanco. Si dos o más ratones mueren o presentan un comportamiento anormal como convulsiones o postración; o si la pérdida de peso es mayor de 2 g en tres o más ratones, la muestra no cumple con los requisitos del ensayo.

Si algunos animales inyectados con la muestra presentan síntomas leves de reactividad biológica y no más de un animal presenta graves síntomas de reactividad biológica o muere, repetir el ensayo empleando grupos de diez ratones.

Luego de repetir el ensayo, la muestra cumple con los requisitos del ensayo si, durante el período de observación, ninguno de los animales inyectados con la muestra presenta un grado de reacción mayor que el observado en los animales inyectados con el blanco.

Este ensayo se emplea para evaluar las respuestas locales a los extractos en estudio, luego de la inyección intracutánea en conejos.

Animales - Seleccionar conejos albinos de piel fina, cuyo pelaje pueda ser rasurado sin provocar irritación o trauma mecánico en la piel. En el manipuleo de los animales evitar tocar el lugar de la inyección, salvo para discriminar entre edema y residuo de aceite. [NOTA: pueden emplearse conejos que hayan sido empleados previamente en ensayos no relacionados, como por ej., para la determinación de piretógenos y hayan permanecido sin tratar durante el período de recuperación indicado, además de presentar la piel totalmente limpia y sin manchas.]

Procedimiento - [NOTA: agitar vigorosamente cada extracto antes de extraer la dosis a inyectar para asegurar una perfecta homogeneización de la muestra.] Rasurar el pelo del animal antes del ensayo, a ambos lados de la columna vertebral en una extensión suficientemente amplia para el ensayo. Evitar irritación o traumatismo mecánico. Extraer el pelo remanente por aspiración. Si fuera necesario, limpiar la piel suavemente con alcohol diluido y secarla antes de la inyección. Puede emplearse más de un extracto por cada tipo de material por conejo, si se ha determinado que esto no altera el resultado del ensayo. Emplear dos animales para cada muestra e inyectarlos intracutáneamente empleando un lado para la muestra y el opuesto para el blanco, según se indica en la Tabla 6. [NOTA: diluir cada gramo del Extracto de la muestra preparado con polietilenglicol 400 y el blanco correspondiente, con 7,4 volúmenes de Solución fisiológica (SR) estéril, hasta obtener una concentración de aproximadamente 120 mg de polietilenglicol por ml.]

Interpretación de los resultados - Examinar la presencia de eritema, edema y necrosis como reacciones del tejido en los sitios de inyección. Lavar la piel suavemente, si fuera necesario, con alcohol diluido para facilitar la observación de los sitios de inyección. Observar todos los animales a las 24, 48 y 72 horas posteriores a la inyección.

Calificar las observaciones según se indica en la Tabla 4. Recortar el pelo, si fuera necesario, durante el período de observación. La calificación promedio para eritema y edema en los sitios de inyección de muestra y blanco se determina en cada período de tiempo (24, 48 y 72 horas) para cada conejo. Una vez transcurridas las 72 horas, todas las calificaciones para eritema más todas las calificaciones para edema se totalizan separadamente para muestra y blanco. Dividir cada total por 12 (dos animales por 3 períodos de calificación por 2 categorías de calificación) para determinar la calificación promedio total de cada muestra frente a su correspondiente blanco. La muestra cumple con los requisitos del ensayo si la diferencia entre la calificación promedio total de la muestra y del blanco es igual o menor a 1,0. Si en algún período de observación la reacción promedio de la muestra es significativamente mayor a la reacción promedio del blanco, repetir el ensayo empleando tres conejos adicionales. La muestra cumple con los requisitos del ensayo si la diferencia entre la calificación promedio de la muestra y del blanco es igual o menor a 1,0.

Este ensayo se emplea para evaluar materiales plásticos y otros materiales poliméricos destinados a estar en contacto directo con tejidos vivos. Es sumamente importante la apropiada preparación de los implantes y su implantación en condiciones asépticas.

Preparación muestra - Preparar para la implantación 8 tiras de muestra y 4 tiras de la Sustancia de referencia. Cada tira debe medir no menos de 10 mm x 1 mm. Los bordes de las tiras deben ser tan lisos como sea posible para evitar traumas mecánicos, adicionales a la implantación. Las tiras se implantan por medio de una aguja hipodérmica con punta intravenosa. Emplear agujas preesterilizadas dentro de las cuales las tiras de plástico son insertadas asépticamente o insertar cada tira limpia dentro de una aguja y someterla luego a un procedimiento de esterilización apropiado. [NOTA: realizar un desgasificado apropiado si agentes tales como óxido de etileno son empleados.]

Animales - Seleccionar conejos adultos sanos que pesen no menos de 2,5 kg y cuyo músculos paravertebrales sean suficientemente grandes en tamaño para permitir la implantación de las muestras. No emplear ningún otro tejido muscular distinto que el paravertebral. Los animales deben ser anestesiados con un grado de profundidad que inhiba los movimientos musculares.

Procedimiento - Realizar el ensayo en un área limpia. En el día del ensayo o dentro de las 20 horas previas, rasurar el pelo de los animales a ambos lados de la columna vertebral. Extraer el pelo remanente por aspiración. Limpiar suavemente la piel con alcohol diluido antes de la inyección.

Implantar en el músculo paravertebral de dos conejos, 4 tiras de la muestra en sitios ubicados a una distancia de 2,5 a 5 cm de la línea media, paralelos a la columna vertebral y separados entre sí por 2,5 cm. De manera similar, implantar 2 tiras de la Sustancia de referencia, en el lado opuesto de la columna vertebral de cada animal. Insertar un estilete estéril dentro de la aguja para ayudar a implantar la muestra en el tejido mientras se retira la aguja. Si se observa excesivo sangrado luego de la implantación de una tira, colocar un duplicado en otro sitio.

Mantener los animales por un período no menor de 120 horas y sacrificarlos al finalizar dicho período administrando una sobredosis de un agente anestésico u otro agente apropiado.

Esperar suficiente tiempo para cortar el tejido sin sangrado.

Interpretación de los resultados - Examinar empleando una lupa y una fuente de luz auxiliar el área de tejido que rodea cada implante. Observar los sitios de implante de la muestra y de la Sustancia de referencia para detectar hemorragia, necrosis; decoloraciones e infecciones y registrar las observaciones. Medir la encapsulación, si la hubiere, registrando el ancho de la cápsula (desde la periferia del sitio del implante de la muestra o de la Sustancia de referencia hasta la periferia de la cápsula) con una aproximación de 0,1 mm. Calificar la encapsulación de acuerdo a la Tabla 7. Calcular las diferencias entre el promedio de la calificación para los sitios de la muestra y de la Sustancia de referencia. La muestra cumple con los requisitos si la diferencia no es mayor de 1,0 o si la diferencia entre las calificaciones medidas de la muestra y la Sustancia de referencia para más de uno de los cuatro sitios de implante no es mayor de 1,0 para alguno de los animales implantados.