La espectrofotometría de fluorescencia es una técnica empleada para determinar la concentración de una sustancia comparando la intensidad de luz fluorescente emitida por la misma con la emitida por la Sustancia de referencia correspondiente, en las mismas condiciones.

Aparato - Se pueden emplear dos tipos de aparatos, fluorómetro de filtro y espectro-fluorómetro. El primero consta de los siguientes componentes:

— Una fuente de radiación, generalmente una lámpara de mercurio o tungsteno.

— Un filtro primario colocado entre la fuente de radiación y la celda, para seleccionar la longitud de onda de excitación.

— Una celda para contener la muestra.

— Un filtro secundario colocado entre la celda y el detector, que actúa como un filtro interruptor fino que permite transmitir la radiación fluorescente, bloqueando en cambio la radiación dispersa.

— Un detector de fluorescencia colocado de manera que forme un ángulo de 90° con respecto a la dirección del haz de luz incidente, con el objeto de minimizar la interferencia de la luz transmitida.

El espectrofluorómetro presenta los mismos componentes que el fluorómetro de filtro, sólo que los filtros se han reemplazado por sistemas monocromadores como prismas o redes de difracción, siendo frecuentemente empleada una lámpara de arco de xenón a alta presión como fuente de radiación.

Procedimiento - Ajustar la lectura del aparato a cero empleando el solvente o mezcla de solventes indicados para disolver la muestra, a la longitud de onda especificada en la monografía correspondiente. Transferir a la celda un volumen apropiado de una solución estándar preparada a partir de la Sustancia de referencia correspondiente y regular la sensibilidad del aparato de modo que la lectura sea mayor a 50. Si el segundo ajuste se realiza modificando la apertura de las rendijas, ajustar nuevamente a cero el aparato y medir nuevamente la intensidad de fluorescencia de la solución estándar. Disolver la muestra en el solvente o mezcla de solventes especificados en la monografía correspondiente. Transferir un volumen apropiado de esta solución a la celda y medir la intensidad de la luz emitida en las mismas condiciones. Calcular la concentración de la sustancia en la solución muestra, por la fórmula siguiente:

C_EI_M/I_E

en la cual C_E es la concentración de la solución estándar, I_M es la intensidad de luz emitida por la solución muestra e I_E es la intensidad de luz emitida por la solución estándar.

Realizar el ensayo dentro del intervalo de concentraciones en el cual la respuesta es lineal.