La espectrofotometría en el ultravioleta y visible consiste en la medida de la absorción de las radiaciones electromagnéticas comprendidas en un intervalo espectral de 200 a 400 nm para la región ultravioleta y de 400 a 700 nm para la región visible.

El grado en que la radiación es absorbida al pasar a través de un medio homogéneo se expresa en términos de absorbancia, A. La absorbancia de una solución es el logaritmo decimal de la inversa de la transmitancia, T, siendo esta última definida: como la fracción de radicación incidente que logra atravesar la muestra. Para una radiación monocromática, A se calcula mediante la siguiente expresión:

A = log (1/T) = log (I_o/I)

donde I_o es la intensidad de radiación incidente e I es la intensidad de radiación transmitida.

De acuerdo con la ley de Lambert-Beer, la absorbancia es proporcional al paso óptico, d, de la capa absorbente atravesada por la radiación y a la concentración, c, del analito:

A = kdc-

La constante de proporcionalidad, k, asume distintas denominaciones según las unidades en que d y c son expresadas:

Absortividad (a): es la absorbancia de una solución cuya concentración, c, es de 1 g por litro, medida en una celda de paso óptico, d, de 1 cm.

a = A/cd

Coeficiente de extinción específica [E(1 %, 1 cm)]: es la absorbancia de una solución cuya concentración, c, es del 1 %, medida en una celda de paso óptico, d, de 1 cm

E (1 %, 1 cm) = A/cd = 10 a

Absortividad molar (Î): es la absorbancia de una solución cuya concentración es 1 mol por litro, medida en una celda de paso óptico, d, de 1 cm. Puede calcularse como el producto de la absortividad por el peso molecular, PM, del analito.

Î= a PMLos

valores de a, E (1 %, 1 cm) y Î, a una longitud de onda específica y en un solvente determinado son característicos del analito.

Aparato - Consta de un sistema óptico capaz de producir luz monocromática en la región de 200 a 800 nm, un dispositivo para seleccionar una banda angosta de longitudes de onda, una celda para contener la muestra y un detector apropiado para determinar la absorbancia.

Cuando se emplean aparatos de doble haz, la celda que contiene el blanco se coloca en el haz de referencia. Las celdas empleadas para la solución muestra y el blanco deben tener las mismas características espectrales.

Calibración del aparato - Los aparatos empleados para registrar los espectros ultravioleta y visible indicados en esta Farmacopea deben cumplir con los siguientes ensayos:

Verificación de la escala de longitud de onda - La escala de longitud de onda puede verificarse midiendo los máximos de absorbancia de una solución estándar de perclorato de holmio a 241,15; 287,15; 361,50 y 536,30 nm, los máximos de absorbancia correspondientes a las líneas de emisión de una lámpara de hidrógeno a 486,10 nm o deuterio a 486,00 nm, o las líneas de un arco de vapor de mercurio a 253,70; 302,25; 313,16; 334,15; 365,48; 404,66; 435,83; 546,07; 576,96 y 579,07 nm. La tolerancia permitida es de ± 1 nm para el ultravioleta y ± 3 nm para el visible.

Control de absorbancias - Controlar la absorbancia con una solución de dicromato de potasio preparada según se indica a continuación:

Solución de dicromato de potasio - Transferir a un matraz aforado de 1 litro aproximadamente 60 mg de dicromato de potasio, exactamente pesados y previamente secados a 130 ºC hasta peso constante. Disolver y diluir a volumen con ácido sulfúrico 0,005 M.

Registrar el espectro de la Solución de dicromato de potasio y determinar las absorbancias a las longitudes de onda especificadas en la Tabla. Los valores de E (1 %, 1 cm) deben estar dentro de las tolerancia especificadas.

Límite de luz espuria - La absorbancia de una solución de cloruro de potasio al 1,2 %, medida -a 200 nm con un paso óptico de 1 cm, empleando agua como blanco, debe ser mayor de 2.

Resolución (para análisis cualitativo) - Registrar el espectro de una solución de tolueno al 0,02 % en hexano. La relación entre el máximo de absorbancia a 269 nm, y el mínimo a 266 nm no debe ser menor de 1,5.

Asimismo, deberán tenerse las siguientes precauciones:

Ancho de rendija (para análisis cuantitativo) -Cuando se mide la absorbancia a un máximo de absorción y cuando se emplea un aparato con ancho de rendija variable a la longitud de onda seleccionada, el ancho de rendija debe ser pequeño comparado con la mitad del ancho de la banda de absorción. Sin embargo, debe ser lo más grande posible para obtener un valor alto de I_o y debe ser tal que una reducción adicional no resulte en un aumento de la lectura de absorbancia.

Celdas - Las absorbancias de las celdas de lectura, cuando se llenan con el mismo solvente, deben ser iguales. Si este no es el caso, debe aplicarse una corrección apropiada.

La tolerancia en el paso óptico de las celdas empleadas es ± 0,005 cm. Las celdas deben limpiarse y manipularse con cuidado.

Solventes - Cuando se mide la absorbancia de una solución a una longitud de onda determinada, la absorbancia de la celda de referencia y su contenido no debe ser mayor de 0,4 y es conveniente que sea menor de 0,2 cuando se mide en referencia al aire a la misma longitud de onda. El solvente en la celda de referencia debe ser del mismo lote que el empleado para preparar la solución muestra.

Determinación de la absorbancia - A menos que se especifique de otro modo en la monografía correspondiente, medir la absorbancia a la longitud de onda especificada empleando celdas de 1 cm de paso óptico y efectuar las medidas con referencia al solvente o solventes empleados para preparar la solución muestra. En caso de que las medidas se deban efectuar con referencia a una mezcla de reactivos, los detalles se describen en las monografías correspondientes.

Cuando en una monografía se especifica la longitud de onda a la cual se presenta un máximo de absorción, implica que dicho máximo presenta una tolerancia de ± 2 nm.

Cuando un ensayo indica el empleo de una Sustancia de referencia, se deben realizar las medidas espectrofotométricas con la solución preparada a partir de la Sustancia de referencia y luego con la solución correspondiente preparada a partir de la muestra. Efectuar las medidas en sucesión inmediata, empleando la misma celda y las mismas condiciones experimentales.

Identificación por medio de Sustancias de referencia - Cuando en una monografía se especifica un ensayo de identificación por espectrofometría ultravioleta, la solución muestra y la solución estándar deben medirse en celdas de 1 cm de paso óptico, en el intervalo espectral comprendido entre 200 y 400 mm, a menos que se especifique de otro modo en la monografía correspondiente.

Disolver una porción de la muestra en el Solvente especificado para obtener una solución con una concentración conocida aproximadamente igual a la especificada en Concentración en la monografía correspondiente. En forma similar, preparar una Solución estándar que contenga la Sustancia de referencia correspondiente.

Registrar en sucesión inmediata los espectros de la Solución muestra y la Solución estándar. Calcular los coeficientes de extinción específica y/o la relación de absorbancias según se especifica en la monografía correspondiente. Los requisitos se cumplen si los espectros de absorción ultravioleta de la Solución muestra y la Solución estándar presentan máximos y mínimos a las mismas longitudes de onda, y los coeficientes de extinción específica y/o la relación de absorbancias están dentro de los límites especificados en dicha monografía.