Indice de acidez - Es la cantidad, en mg, de hidróxido de potasio necesaria para neutralizar los ácidos libres presentes en 1,0 g de muestra.

Indice de esterificación - Es la cantidad, en mg,, de hidróxido de potasio necesaria para saponificar los ésteres presentes en 1,0 g de muestra.

Indice de hidroxilo - Es la cantidad, en mg, de hidróxido de potasio equivalente al contenido de hidroxilo de 1,0 g de muestra.

Indice de yodo - Es la cantidad, en g, de iodo capaz de ser fijado, bajo las condiciones indicadas, por 100 g de muestra.

Indice de saponificación - Es la cantidad, en mg, de hidróxido de potasio necesaria para neutralizar los ácidos libres y saponificar los ésteres presentes en 1,0 g de muestra.

Si la muestra se presenta turbia debido a la presencia de estearina, calentar el envase en un baño de agua a 50 °C hasta que quede límpida; si el aceite no se clarifica por calentamiento, filtrarlo a través de un papel de filtro seco en un embudo que se pueda mantener caliente. Mezclar y pesar, de una vez, tantas porciones como se necesiten para las distintas determinaciones. Mantener la muestra fundida hasta que se hayan tomado las porciones necesarias.

Determinar la densidad relativa de una grasa o aceite según se indica en <160>. Determinación de la densidad relativa.

Determinar la temperatura de fusión según se indica para el Método II en <260>. Determinación del punto difusión.

Aislamiento de los ácidos grasos - Calentar en un vaso de precipitados de 800 ml a 150 °C, 75 ml desolución de hidróxido de potasio -glicerina, preparada disolviendo 25 g de hidróxido de potasio en 100 ml de glicerina, y agregar 50 ml de la grasa clarificada. Calentar la mezcla durante 15 minutos con agitación frecuente, evitando que la temperatura sobrepase los 150 °C. La saponificación se considera completa cuando la mezcla se presenta homogénea, sin partículas adheridas al vaso en el menisco. Verter el contenido del vaso de precipitados en 500 ml de agua próxima a hervir en un segundo vaso de precipitados o en una cápsula de 800 ml. Agregar lentamente 50 ml de ácido sulfúrico diluido, preparado mezclando 3 partes de agua con 1 parte de ácido sulfúrico, y calentar la solución, con agitación frecuente, hasta que los ácidos grasos se separen como una capa transparente. Lavarlos con agua hirviendo hasta que estén exentos de ácido sulfúrico y recolectarlos en un vaso de precipitados. Calentar en un baño de vapor hasta que el agua se separe y los ácidos grasos formen una capa clara; filtrar en un vaso de precipitados seco mientras se calienta y secar a 105 °C durante 20 minutos. Transferir los ácidos grasos aún calientes a un recipiente apropiado y enfriar en un baño de hielo hasta que se produzca la solidificación.

Ensayo de saponificación completa - Transferir 3 ml de los ácidos grasos aislados a un erlenmeyer y agregar 15 ml de alcohol. Calentar la solución a ebullición y agregar un volumen igual de hidróxido de amonio 6 N. La solución deberá permanecer límpida.

Procedimiento - Proceder según se Indica para el Procedimiento en <180>. Determinación de la temperatura de solidificación. El promedio de no menos de cuatro lecturas consecutivas de la mayor temperatura observada, es la temperatura de solidificación de los ácidos grasos.

A menos que se especifique de otro modo en la monografía correspondiente, disolver aproximadamente 10,0 g de muestra, exactamente pesados y previamente neutralizados frente a la fenolftaleína con hidróxido de sodio 0, 1 N, en 50 ml de una mezcla de volúmenes iguales de alcohol y éter, contenida en un erlenmeyer. Si la muestra no se disuelve en el solvente frío, adaptar al erlenmeyer un condensador apropiado y calentar suavemente, agitando hasta disolución. Agregar 1 ml de fenolftaleína (SR). Titular con hidróxido de sodio 0,1 N (SV) hasta coloración rosada persistente durante 30 segundos. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Calcular el Indice de acidez o el volumen de álcali 0, 1 N requerido para neutralizar 10,0 g de muestra (ácidos grasos libres), según corresponda.

Si el volumen de hidróxido de sodio 0,1 N (SV) requerido para la titulación es menor de 2 ml, puede emplearse un titulante más diluido o ajustarse convenientemente el tamaño de la muestra. Los resultados pueden expresarse en función del volumen de titulante empleado o en función del volumen equivalente de hidróxido de sodio 0,1 N.

Si el aceite ha sido saturado con dióxido de carbono para su conservación, calentar a reflujo suavemente la solución de alcohol-éter durante 10 minutos antes de la titulación. El dióxido de carbono presente en el aceite puede eliminarse también colocándolo en un cristalizador dentro de un desecador al vacío durante 24 horas antes de pesar la muestra.

Transferir 1,5 a 2 g de muestra, exactamente pesados, a un erlenmeyer de 250 mI, previamente pesado, y agregar 25,0 mI de hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N (SV). Calentar en un baño de vapor, con un refrigerante apropiado para mantener el reflujo durante 30 minutos, agitando por rotación frecuentemente. Agregar 1 ml de fenolftaleína (SR) y titular el hidróxido de potasio en exceso con ácido clorhídrico 0,5 N (SV). Realizar una determinación con un blanco (ver Titulaciones residuales en <780>.

Volumetría). La diferencia entre los volúmenes, en ml, de ácido clorhídrico 0,5 N consumido por la muestra y el blanco, multiplicado por 28,05 y dividido por el peso, en g, de la muestra, es el Indice de saponificación.

Si el aceite ha sido saturado con dióxido de carbono para su conservación, colocarlo en un cristalizador dentro de un desecador al vacío durante 24 horas antes de pesar la muestra para el ensayo.

[NOTA: si se han determinado el Indice de saponificación y el Indice de acidez, por diferencia entre estos se obtiene el Indice de esterificación.]

Transferir entre 1,5 y 2 g de muestra, exactamente pesados, a un erlenmeyer de 250 ml, previamente pesado. Agregar entre 20 y 30 ml de alcohol neutralizado, agitar y agregar 1 mI de fenolftaleína (SR). Titular con hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N (SV) hasta neutralizar totalmente los ácidos grasos, libres. Agregar 25,0 ml de hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N (SV) y proceder según se indica en Indice de saponificación, comenzando donde dice "Calentar en un baño de vapor..." pero omitiendo el agregado adicional de fenolftaleína (SR). Realizar una determinación con un blanco. La diferencia entre los volúmenes, en mI, de ácido clorhídrico 0,5 N consumido por la muestra y el blanco, multiplicado por 28,05 y dividido por el peso, en g, de la muestra tomada, es el Indice de esterificación.

Reactivo piridina-anhídrido acético - Antes de comenzar el ensayo, mezclar 3 volúmenes de piridina recientemente destilada con 1 volumen de anhídrido acético recientemente destilado.

Procedimiento - Transferir una cantidad de muestra (determinada según la Tabla 1), exactamente pesada, a un erlenmeyer de 250 mI con tapón de vidrio y agregar 5,0 mI de Reactivo piridina-anhídrido acético. Transferir 5,0 mI de Reactivo piridina-anhídrido acético a un segundo erlenmeyer de 250 ml con tapón de vidrio, que será empleado como blanco. Acoplar a ambos erlenmeyer, refrigerantes apropiados con juntas esmeriladas. Calentar en un baño de vapor durante 1 hora, agregar 10 ml de agua a través de cada refrigerante y calentar, en el baño de vapor durante 10 minutos adicionales. Enfriar y agregar, a cada erlenmeyer, 25 ml de alcohol butílico previamente neutralizado frente a fenolftaleína (SR) con hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N; vertiendo los primeros 15 ml a través de cada refrigerante y, luego de retirar los refrigerantes, lavar las paredes de ambos erlenmeyers con la porción restante de 10 ml. A cada erlenmeyer agregar 1 ml de feriolftaleína (SR) y titular con hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N (SV). Registrar el volumen consumido por el ácido residual en la solución muestra como T y el consumido por el blanco como B. Transferir aproximadamente 10 g de muestra, exactamente pesados, a Un erlenmeyer de 125 ml y mezclar con 10 ml de piridina recientemente destilada, neutralizada previamente frente a fenolftaleína (SR). Agregar 1 ml de fenoltaleína (SR) y titular con hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N (SV). Registrar el volumen constituido por los ácidos grasos libres presentes en la muestra como A, o emplear el índice de acidez para obtener A . Calcular el Indice de hidroxilo por la fórmula siguiente:

(56,11N/P)[B + (PA/C) -T]

en la cual P y C son los pesos de la muestra, en g, tomados para la acetilación y para la determinación de ácidos libres, respectivamente, N es la normalidad exacta del hidróxido de potasio alcohólico, 56,11 es el peso molecular del hidróxido de potasio y los otros términos son los definidos anteriormente.

A menos que se especifique de otro modo en la monografía correspondiente, determinar el Indice de iodo por el Método I.

Procedimiento - Transferir aproximadamente 800 mg de grasa sólida o 200 mg de aceite, exactamente pesados, a un matraz para iodo de 250 ml. Disolver en 10 ml de cloroformo, agregar 25,0 ml de bromuro de iodo (SR), tapar perfectamente y dejar en reposo durante 30 minutos al abrigo de la luz, agitando ocasionalmente. Agregar 30 ml de ioduro de potasio (SR) y 100 ml de agua, en ese orden. Titular el iodo liberado con tiosulfato de sodio 0,1 N (SV), agitando vigorosamente después de cada agregado de tiosulfato. Cuando el color del iodo se toma muy pálido, agregar 3 ml de almidón (SR) y continuar la titulación con tiosulfato de sodio 0,1 N (SV) hasta que el color azul desaparezca. Realizar una determinación con un blanco (Ver Titulaciones residuales en 780. Volumetría). La diferencia entre los volúmenes, en ml, de tiosulfato de sodio 0,1 N (SV) consumido por la muestra y el blanco, multiplicado por 1,269 y dividido por el peso, en g, de la muestra, es el Indice de yodo.

[NOTA: si más de la mitad del bromuero de iodo (SR) es absorbido por la porción de muestra tomada, repetir la determinación, empleando una muestra de menor tamaño.]

Solución de ioduro de potasio - Disolver 10,0 g de loduro de potasio en agua para obtener 100 ml. Almacenar en envases inactínicos.

Solución indicadora de almidón - Mezclar 1 g de almidón soluble con cantidad suficiente de agua fría para hacer una pasta fina. Agregar esta pasta, con agitación, a 100 ml de agua hirviendo, mezclar y enfriar. Emplear solamente la solución clara.

Procedimiento - Fundir la muestra, si es sólida. [NOTA: la temperatura no debe ser mayor que el punto de fusión de la muestra en más de 10 °C.] Filtrar a través de dos piezas de papel de filtro para eliminar las impurezas sólidas y las trazas de humedad. La filtración puede realizarse en una estufa a 100 °C pero debe completarse en no más de 5 minutos ± 30 segundos. La muestra debe estar totalmente seca. Todos los materiales de vidrio deben estar limpios y completamente secos. Luego de la filtración, dejar que la muestra filtrada alcance una temperatura entre 68 y 71 ± 1 °C, antes de pesarla. Una vez que la muestra ha alcanzado la temperatura indicada, pesar de inmediato en un matraz para iodo de 500 ml. Emplear los pesos y exactitud de pesaje indicados en fa Tabla 2. [NOTA: el peso de la muestra debe ser tal que el exceso de cloruro de iodo (SR) sea entre 50 y 60 % de la cantidad agregada, o sea, entre 100 y 150 o de la cantidad absorbida.] Agregar 15 ml de una mezcla de ciclohexano y ácido acético (1:1) y agitar hasta disolución. Agregar 25,0 ml de cloruro de iodo (SR), tapar perfectamente el matraz y mezclar. Dejar reposar, al abrigo de la luz, a 25 ± 5 °C, con agitación ocasional, durante 1 hora para un índice de iodo menor a 150 o durante 2 horas para un índice de iodo mayor o igual a 150. Dentro de los 3 minutos después del tiempo de reacción indicado, agregar, 20 ml de Solución de ioduro de potasio y 150 ml de agua recientemente hervida y enfriada en ese orden y mezclar. Dentro de los siguientes 30 minutos, titular el iodo liberado con tiosulfato de sodio 0,1 N (SV), agitando mecánicamente después de cada agregado de tiosulfato. Cuando el color amarillo del iodo casi haya desaparecido, agregar 1 a 2 ml de Solución indicadora de almidón y continuar la titulación con tiosulfato de sodio 0,1 N (SV) hasta que el color azul desaparezca. Realizar una determinación con un blanco (ver Titulaciones residuales en 780. Volumetría). La diferencia entre los volúmenes de tiosulfato de sodio 0,1 N consumidos por el blanco y la muestra, multiplicada por 1,269 y dividido por el peso, en g, de la muestra, es el Indice de iodo.

Materia insaponificable - En aceites o grasas se refiere a aquellas sustancias que no son saponificables por hidróxidos alealinos pero son solubles en los solventes grasos comunes y a productos de saponificación que son solubles en dichos solventes.

Procedimiento - Transferir aproximadamente 5,0 g, exactamente pesados, del aceite o grasa, a un erlenmeyer de 250 ml. Agregar 50 ml de una solución de hidróxido de potasio alcohólico, preparada disolviendo 12 g de hidróxido de potasio en 10 ml de agua y diluyendo con alcohol a 100 ml. Calentar el erlenmeyer en un baño de vapor con un refrigerante apropiado para mantener el reflujo durante 1 hora, agitando por rotación frecuentemente. Enfriar a una temperatura por debajo de 25 °C, transferir el contenido del erlenmeyer a una ampolla de decantación con un robinete de politetrafluoretileno y lavar el erlenmeyer con dos porciones de 50 ml de agua que se agregan a la ampolla de decantación. [NOTA: no emplear grasa en el robinete.] Extraer con tres porciones de 100 ml de éter, combinando los extractos etéreos en otra ampolla de decantación que contenga 40 mI de agua. Agitar suavemente la ampolla de decantación durante algunos minutos. [NOTA: una agitación violenta puede provocar la formación de una emulsión difícil de separar.] Dejar que la mezcla se separe y descartar la fase acuosa inferior. Lavar el extracto etéreo con dos porciones de 40 mI de agua adicionales y descartar la fase acuosa inferior. Lavar el extracto etéreo sucesivamente con una porción de 40 ml de una solución de hidróxido de potasio (3 en 100) y una porción de 40 ml de agua. Repetir tres veces la secuencia de lavado con solución de hidróxido de potasio y agua. Lavar el extracto etéreo con porciones de 40 ml de agua hasta que el último lavado no se coloree por el agregado de 2 gotas de fenolftaleína (SR). Transferir el extracto etéreo a un erlenmeyer previamente pesado y lavar la ampolla de decantación con 10 ml de éter, agregando los lavados al erlenmeyer. Evaporar el éter en un baño de vapor y agregar al residuo 6 ml de acetona. Eliminar la acetona bajo una corriente de aire y secar el residuo a 105 °C hasta peso constante. Calcular el porcentaje de materia insaponificable en la porción de aceite o grasa tomada, por la fórmula siguiente:

100(P_R/P_M)

en la cual P_R es el peso, en g, del residuo y P_M es el peso, en g, del aceite o grasa tomado para el ensayo.

Disolver el residuo en 20 ml de alcohol, previamente neutralizado hasta punto final frente a fenolftaleína. Agregar fenolftaleína (SR) y titular con hidróxido de sodio alcohólico 0,1 N (SV) hasta la aparición de un débil color rosado que persista por no menos de 30 segundos. Si el volumen de hidróxido de sodio alcohólico 0,1 N es mayor de 0,2 ml, la separación de las fases ha sido incompleta y, por lo tanto, el residuo pesado no puede considerarse como materia insaponificable. En tales casos se debe repetir el ensayo.

Sistema cromatográfico - Emplear un equipo para cromatografía de gases con un detector de ionización a la llama, un sistema de inyección sin división (splitless) y una columna capilar de sílice fundida de 30 m x 0,53 mm rellena con una fase estacionaria constituida por polietilenglicol (PM aproximadamente 15.000), de 1,0 µm de espesor. Mantener el inyector y el detector a aproximadamente 220 y 260 °C, respectivamente. Mantener la columna a 70 °C durante aproximadamente 2 minutos después de la inyección; aumentar, a razón de 5 °C por minuto, hasta 240 °C y mantener a esta temperatura durante 5 minutos. Se emplea helio como gas transportador con una velocidad lineal de aproximadamente 50 cm por segundo.

Solución estándar - Preparar una mezcla de ésteres de composición conocida que contenga los ésteres que se especifiquen en la monografía correspondiente. Esta solución puede contener otros componentes. [NOTA: en el comercio existen mezclas de ésteres que pueden emplearse para este propósito.]

Solución muestra - Transferir aproximadamente 100 mg de muestra, exactamente pesados, a un erlenmeyer de 50 ml. [NOTA: si la muestra contiene ácidos grasos con más de dos dobles enlaces, purgar el erlenmeyer con nitrógeno.] Adosar un refrigerante y una barra de agitación magnética, agregar 4 ml de solución de hidróxido de sodio 0,5 N en metanol y calentar a reflujo entre 5 y 10 minutos, hasta que desaparezcan los glóbulos de aceite. Agregar 5 ml de una solución preparada disolviendo 14 g de trifluoruro de boro en 100 ml de metanol. Agitar por rotación para mezclar y calentar a reflujo durante 2 minutos. Agregar 4 ml de n-heptano a través del refrigerante y calentar a reflujo durante 1 minuto. Enfriar, retirar el refrigerante, agregar aproximadamente 15 ml de solución saturada de cloruro de sodio, agitar y dejar que las fases se separen. Filtrar la fase de n-heptano a través de 0,1 g de sulfato de sodio anhidro (previamente lavado con n-heptano). Transferir 1,0 ml del filtrado a un matraz aforado de 10 ml, diluir a volumen con n-heptano y mezclar.

Solución de aptitud del sistenia - Transferir aproximadamente 20 mg de ácido esteárico, 20 mg de ácido palmítico y 20 mg de ácido oleico, exactamente pesados, a un erlenmeyer de 25 ml adaptado a un refrigerante y con una barra de agitación magnética. Proceder según se indica para la Solución muestra, comenzando donde dice "Agregar 5 ml de una solución preparada disolviendo...".

Aptitud del sistema (ver 100. Cromatografía) - Cromatografiar la Solución de aptitud del sistema, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos según se indica en Procedimiento la resolución, R, entre los picos de estearato de metilo y oleato de metilo no es menor de 1,5; los tiempos de retención relativos son aproximadamente 0,87 para palmitato de metilo, 0,99 para estearato de metilo y 1,0 para el oleato de metilo; la desviación estándar relativa de las respuestas de los picos de palmitato de metilo y estearato de metilo para inyecciones repetidas no es mayor de 6,0 % y la desviación estándar relativa del cociente entre las respuestas de los picos del palmitato y el estearato para inyecciones repetidas no es mayor de 1,0 %.

Procedimiento - Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales (aproximadamente 1 µl) de la Solución estándar y la Solución muestra, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de todos los picos de los ésteres de los ácidos grasos. Comparar los tiempos de retención de los picos de los ésteres de los ácidos grasos en el cromatograma de la Solución muestra con los obtenidos en el cromatograma de la Solución estándar. Calcular el porcentaje de cada ácido graso presente en la muestra, por la fórmula siguiente:

100 (A/B)

en la cual A es la respuesta del pico obtenido para cada éster de ácido graso individual y B es la suma de las respuestas de todos los picos, excluyendo el pico del solvente, en el cromatograma obtenido a partir de la Solución muestra.

Aparato - Emplear una centrífuga con un diámetro de giro (d = distancia entre los extremos de los tubos cuando están girando) de 38 a 43 cm y emplearla a una velocidad de aproximadamente 1500 rpm. Si se emplea una centrífuga de diferentes dimensiones, calcular la velocidad requerida, por la fórmula siguiente:

Emplear tubos de centrífuga cónicos graduados y con tapones. La capacidad total de cada tubo debe ser de aproximadamente 125 ml. Las graduaciones deben ser claras y diferenciadas, empezando desde el fondo del tubo hacia arriba según la escala que se indica en la Tabla 3.

Procedimiento - Transferir 50,0 ml de benceno a dos tubos de centrífuga y, a cada tubo, agregar una porción de 50,0 ml del aceite previamente calentado a 25 °C y agitado, si fuera necesario, para incorporar nuevamente la estearina separada. Tapar perfectamente los tubos, agitarlos vigorosamente hasta que el contenido se mezcle completamente y luego sumergirlos en un baño de agua a 50 °C durante 10 minutos. Centrifugar durante 10 minutos. Leer el volumen combinado de agua y sedimento en el fondo de cada tubo. Centrifugar nuevamente durante períodos de 10 minutos hasta que el volumen combinado de agua y sedimento permanezca constante en tres lecturas sucesivas. La suma de los volúmenes de agua y sedimento combinado en los dos tubos representa el porcentaje, en volumen, de agua y sedimento en el aceite.