Los siguientes procedimientos se aplican a la determinación de esteroides codificados en la Farmacopea que poseen grupos funcionales reductores, como por ejemplo a-cetoles. A menos que se especifique de otro modo en la monografa correspondiente, emplear el método de valoración directa.

VALORACION DIRECTA

Solución estándar - Disolver en alcohol una cantidad apropiada de la Sustancia de referencia especificada en la monografía correspondiente, previamente secada bajo las condiciones especificadas y exactamente pesada. Diluir cuantitativamente y en etapas con alcohol hasta obtener una solución con una concentración conocida de aproximadamente 10 µg por ml Transferir 20 ml de esta solución a un erlenmeyer de 50 ml con tapón de vidrio.

Solución muestra - Proceder según se especifique en la monografía correspondiente.

Procedimiento - Agregar a cada uno de los dos erlenmeyer que contienen la Solución muestra y la Solución estándar y a un erlenmeyer similar que contiene 20,0 ml de alcohol que se empleará como blanco, 2,0 ml de una solución preparada disolviendo 50 mg de azul de tetrazolio en 10 ml de metanol, y mezclar. Agregar 2,0 ml de una mezcla de alcohol e hidróxido de tetrametilamonio (SR) (9:1) a cada erlenmeyer, mezclar y dejar reposar en la oscuridad durante exactamente 90 minutos. Determinar las absorbancias de las soluciones obtenidas partir de la Solución muestra y la Solución estándar en celdas de 1 cm, a 525 nm, con un espectrofotómetro apropiado, contra el blanco.

Calcular la cantidad de sustancia valorada empleando la fórmula indicada en la monografía correspondiente, en la cual C es la concentración; en µg por ml, de la Solución estándar y A_M y A_E son las absorbancias de las soluciones obtenidas a partir de la Solución muestra y la Solución estándar, respectivamente.

VALORACION DE UN ESTEROIDE

AISLADO PREVIAMENTE

En el siguiente procedimiento, el esteroide a valorar es separado de los esteroides relacionados y excipientes por cromatografía en capa delgada y valorado luego empleando el método descrito anteriormente. Emplear este método cuando se especifique en la monografía correspondiente.

Preparación de la placa - Preparar una mezcla de 30 g de gel de sílice para cromatografía y una sustancia fluorescente apropiada con 65 ml de una mezcla de agua y alcohol (5:2). Extender la mezcla a una placa, de 20 cmx20 cm hasta obtener una capa uniforme de 0,25 mm de espesor y dejar secar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Activar la placa a 105°C durante 1 hora y almacenar en un desecador.

Fase móvil A - Cloruro de metileno y metanol (45:4).

Fase móvil B - Cloroformo y acetona (4:1).

Solución estándar - Disolver una cantidad apropiada de la Sustancia de referencia especificada en la monografía correspondiente, previamente secada y exactamente pesada, en una mezcla de cloroformo y alcohol (50:50), hasta obtener una solución con una concentración conocida de aproximadamente 2 mg por ml.

Solución muestra - Proceder según se especifique en la monografía correspondiente.

Procedimiento - Dividir la placa cromatográfica en tres secciones iguales; las secciones laterales se emplearán para aplicar la Solución muestra y la Solución estándar, respectivamente. En la sección central se aplicará el blanco. Aplicar 200 µ1 de la Solución muestra y 200 µ1 de Solución estándar en bandas, a una distancia de 2,5 cm del borde de la placa, en la sección correspondiente. Secar con la ayuda de una corriente de aire, sin calentar. Empleando la Fase móvil especificada en la monografía correspondiente, desarrollar la placa hasta que el frente del solvente haya corrido aproximademente 15 cm por encima de la zona de siembra. Retirar la placa de la cámara, marcar el frente del solvente y dejar evaporar. Examinar la placa bajo luz ultravioleta y marcar la banda principal en la sección de la placa correspondiente a la Solución estándar. Marcar también las bandas correspondientes en las secciones de la Solución muestra y del blanco de la placa. Retirar el gel de sílice de cada banda por separado y transferirlo a sendos tubos de centrífuga de 50 ml con tapa de vidrio. A cada tubo agregar 25,0 ml de alcohol y agitar durante 2 minutos. Centrifugar durante 5 minutos, transferir 20 ml de la solución sobrenadante de cada tubo a un erlenmeyer de 50 ml con tapa de vidrio, agregar 2,0 ml de una solución preparada disolviendo 50 mg de azul de tetrazolio en 10 ml de metanol y mezclar. Proceder según se indica en el Procedimiento en Valoración directa, comenzando donde dice: "Agregar 2,0 ml de una mezcla... ".