La valoración microbiológica de antibióticos se realiza comparando, en idénticas condiciones de ensayo, la inhibición de la multiplicación de microorganismos sensibles producida por concentraciones conocidas de una Sustancia de referencia frente a la inhibición producida por diluciones del antibiótico que se está valorando. Estos ensayos ponen de manifiesto la verdadera actividad antimicrobiana del producto. En este capítulo se presentan los procedimientos para la valoración de los antibióticos de esta Farmacopea, para los cuales la valoración microbiológica es el método de referencia.

Las Sustancias de referencia empleadas en los ensayos microbiológicos son sustancias cuya potencia (actividad) ha sido determinada con precisión frente una Sustancia de referencia trazable al patrón internacional o a la preparación de referencia internacional correspondiente.

El ensayo debe ser diseñado de forma tal que permita verificar la validez del modelo matemático sobre el que se basa la ecuación del cálculo de potencia. Si se escoge un modelo de líneas paralelas, las dos rectas formadas por logaritmo de dosis y respuestas (o respuesta transformada) correspondientes a la preparación muestra y a la preparación de referencia deben ser paralelas. Asimismo, deben ser lineales en el intervalo de dosis empleado para el cálculo. También ambas rectas deben tener una regresión significativa. Estas condiciones deben verificarse mediante pruebas de validez para una determinada probabilidad, generalmente p=0,05.

Para determinar si un antibiótico cumple con los requisitos de potencia especificados en la monografía correspondiente; debe repetirse la valoración y combinarse los resultados estadísticamente hasta lograr la precisión requerida. Esta debe ser tal que los límites de confianza (P=0,95), expresados porcentualmente, se encuentren dentro del intervalo de potencia especificado en la monografía correspondiente:

Se emplean dos métodos generales: método de difusión en agar o en placa y método turbidimétrico o en tubo. El primero se basa en la difusión del antibiótico desde un punto de aplicación, a través de una capa de agar inoculado con el microorganismo de ensayo. La difusión origina zonas o halos de inhibición del microorganismo, cuyo tamaño (diámetro) esta en relación con la concentración de antibiótico. El método turbidimétrico se efectúa en un medio de cultivo líquido inoculado con un microorganismo de ensayo, al que se le agregan concentraciones crecientes del antibiótico. Luego del período de incubación se determina la turbidez producida por el desarrollo microbiano, la cual esta en función de la concentración del ántibiótico.

Para obtener el intervalo de concentraciones de trabajo, debe realizarse previamente una curva dosis-respuesta y aplicar los métodos estadísticos apropiados (ver Cálculos).

La potencia de los antibióticos se expresa en Unidades o µg de actividad. En cada caso, la Unidad o µg de actividad antibiótica se establece y define internacionalmente. [NOTA: no se debe asumir que la Unidad debe necesariamente corresponder a los µg (peso) del antibiótico].

Las soluciones reguladoras se deben esterilizar luego de ser preparadas y el pH recomendado en cada caso corresponde al determinado luego de su esterilización.

Solución reguladora N° 1 (1%; pH 6,0) -Disolver 2,0 g de fosfato dibásico de potasio y 8,0 g de fosfato monobásico de potasio en 1 litro de agua. Ajustar a pH 6,00 ± 0,05 con ácido fosfórico 18 N o hidróxido de potasio 10 N.

Solución reguladora N° 3 (0,1 M; pH 8,0) -Disolver 16,73 g de fosfato dibásico de potasio y 0,523 g de fosfato monobásico de potasio en 1 litro de agua. Ajustar a pH 8,0 ± 0,1 con ácido fosfórico 18 N o hidróxido de potasio 10 N.

Solución reguladora N° 4 (0,1 M; pH 4,5) Disolver 13,61 g de fosfato monobásico de potasio en 1 litro de agua. Ajustar a pH 4,50 ± 0,05 con ácido fosfórico 18 N o hidróxido de potasio 10 N.

Solución reguladora N ° 6 (10%; pH 6,0) -Disolver 20,0 g de fosfato dibásico de potasio y 80,0 g de fosfato monobásico de potasio en 1 litro de agua. Ajustar a pH 6,00 ± 0,05 con ácido fosfórico 18 N o hidróxido de potasio 10 N.

Solución reguladora N° 10 (0,2 M; pH 10,5) -Disolver 35,0 g de fosfato dibásico de potasio en 1 litro de agua y agregar 2 ml de hidróxido de potasio 10 N. Ajustar a pH 10,5 ± 0,1 con ácido fosfórico 18 N o hidróxido de potasio 10 N.

Solución. regulación N° 16 (0,1 M; Ph 10, 7,0) -Disolver 13,6 g de fosfato dibásico de potasio y 4,0 g de fosfato monobásico de potasio en 1 litro de agua. Ajustar a pH 7,0 ± 0,2 con ácido fosfórico 18 N o hidróxido de potasio 10 N.

Otras soluciones - Emplear las sustancias especificadas en Reactivos y Soluciones. Cuando se indique agua, emplear Agua purificada; cuando se indique solución fisiológica, emplear Solución Inyectable de cloruro de sodio; cuando se indique formaldehído diluido, emplear Solución de formaldehído diluida 1:3 con agua.

Los medios empleados para la preparación del inóculo microbiano y para la realización del ensayo están constituidos por los componentes que se indican a continuación. Se admiten modificaciones menores de los componentes individuales o el empleo de medios deshidratados reconstituidos, siempre que los medios resultantes posean iguales o mejores propiedades para estimular el desarrollo microbiano y proporcionen una curva dosis-respuesta, similar.

Se deben disolver los componentes y agregar agua hasta obtener un litro. Se requiere que las soluciones se ajusten con hidróxido de sodio 1 N o con ácido clorhídrico 1 N de manera que luego de la esterilización por vapor se obtenga el pH especificado.

Medio 1

Peptona ........................................................................................................................... 6,0 g

Digerido pancreático de caseína ........................................................................................ 4,0 g

Extracto de levadura ......................................................................................................... 3,0 g

Extracto de carne vacuna .................................................................................................. 1,59,

Dextrosa ........................................................................................................................... 1,0 g

Agar .................................................................................................................................. 5,0 g

Agua c.s.p. .................................................................................................................... 1000 ml

pH después de la esterilización: .................................................................................... 6,6 ± 0,1.

Medio 2

Peptona .............................................................................................................................. 6,0 g

Extracto de levadura ........................................................................................................... 3,0 g

Extracto de carne vacuna .................................................................................................... 1,5 g

Agar ................................................................................................................................. 15,0 g

Agua c.s.p. ..................................................................................................................... 1000 ml

pH después de la esterilización: ..................................................................................... 6,6 ± 0,1.

Medio 3.

Peptona .............................................................................................................................. 5,0 g

Extracto de levadura ........................................................................................................... 1,5 g

Extracto de carne vacuna .................................................................................................... 1,5 g

Cloruro de sodio .............................................................................................................. .. 3,5 g

Dextrosa ............................................................................................................................. 1,0 g

Fosfato dibásico de potasio ............................................................................................... 3,68 g

Fosfato monobásico de potasio ......................................................................................... 1,32 g

Agua c.s.p. ..................................................................................................................... 1000 ml

pH después de la esterilización: 7,00 ± 0,05

Medio 5

Proceder del mismo modo que para el Medio 2, excepto que el pH final después de la esterilización debe ser: 7,9 ± 0,1.

Medio 8

Proceder del mismo modo que para el Medio 2, excepto que el pH final después de la esterilización debe ser: 5,9 ± 0,1.

Medio 9

Digerido pancreático de caseína .......................................................................................... 7,0 g

Digerido papaínico de soja .................................................................................................. 3,0 g

Cloruro de sodio .............................................................................................................. .. 5,0 g

Fosfato dibásico de potasio ................................................................................................. 2,5 g

Dextrosa .......................................................................................................................... -2-,5 g

Agar ................................................................................................................................. 20;0 g

Agua c.p.s. ..................................................................................................................... 1000 ml

pH después de la esterilización: 7,2 ± 0,1.

Medio 10

Proceder del mismo modo. que para el Medio 9, excepto que se deben emplear 12,0 g de agar en lugar de 20,0 g y agregar 10 ml de Polisorbato 80 después de calentar a ebullición el medio para disolver el agar. El pH después de la esterilización debe ser: 7,2 ± 0,1.

Medio 11

Proceder del mismo modo que para el Medio 1, excepto que el pH final después de la esterilización debe ser: 8,3 ± 0,1.

Medio 13

Dextrosa ........................................................................................................................... 20,0 g

Peptona ............................................................................................................................ 10,0 g

Agua c.p.s. ..................................................................................................................... 1000 ml

pH después de la esterilización: 5,6 ± 0,1.

Medio 19

Peptona ............................................................................................................................... 9,4 g

Extracto de levadura ............................................................................................................ 4,7 g

Extracto de carne vacuna ..................................................................................................... 2,4 g

Cloruro de sodio ................................................................................................................ 10,0 g

Dextrosa ............................................................................................................................ 10,0 g

Agar. ................................................................................................................................. 23,5 g

Agua c.p.s. ...................................................................................................................... 1000 ml

pH después de la esterilización: 6,1 ± 0,1.

Medio 32

Proceder del mismo modo que para el Medio 1, excepto que se deben agregar 0,3 g de sulfato de manganeso.

Medio 34

Glicerina ........................................................................................................................... 10,0 g

Peptona ............................................................................................................................ 10,0 g

Extracto dé carne vacuna .................................................................................................. 10,0 g

Cloruro de sodio ............................................................................................................. .. 3,0 g

Agua c.p.s. .................................................................................................................... 1000 ml

pH después de la esterilización: 7,0 ± 0,1.

Medio 35

Ploceder del mismo modo que para el Medio excepto que se deben agregar 17,0 g de agar.

Medio 36

Digerido pancreático de caseína ........................................................................................ 15,0 g

Digerido papaínico de soja .................................................................................................. 5,0 g

Cloruro de sodio .............................................................................................................. .. 5,0 g

Agar ................................................................................................................................. 15,0 g

Agua c.p.s. ..................................................................................................................... 1000 ml

pH después de la esterilización: 7,3 ± 0,1.

Medio 39

Proceder del mismo modo que para que el Medio 3, excepto que el pH final después de la esterilización debe ser: 7,9 ± 1,0.

Medio 40

Extracto de levadura .......................................................................................................... 20,0 g

Polipeptona ......................................................................................................................... 5,0 g

Dextrosa ............................................................................................................................ 10,0 g

Fosfato monobásico de potasio ............................................................................................ 2,0 g

Polisorbato 80 ..................................................................................................................... 0,1 g

Agar .................................................................................................................................. 10,0 g

Agua c.p.s. ...................................................................................................................... 1000 ml

pH después de la esterilización: 6,7 ± 0,2.

Medio 41

Digerido pancreático de caseína .......................................................................................... 9,0 g

Dextrosa ........................................................................................................................... 20,0 g

Extracto de levadura ............................................................................................................ 5,0 g

Citrato de sodio ................................................................................................................. 10,0 g

Fosfato monobásico de potasio ............................................................................................ 1,0 g

Fosfato dibásico de potasio .................................................................................................. 1,0 g

Agua c.p.s. ....................................................................................................................... 1000 ml

pH después de la esterilización: 6,8 ± 0,1.

Los términos potencia declarada, potencia supuesta, relación de potencia y potencia estimada se emplean para indicar los siguientes conceptos:

Potencia declarada o en etiqueta - En el caso de un producto formulado, es un valor nominal asignado a partir del conocimiento de la potencia del material a granel; en el caso de material a granel, es la potencia estimada por el elaborador.

Potencia supuesta o asumida - Es la potencia provisoriamente asignada de una preparación muestra que forma la base del cálculo de las dosis que podrían ser equipotentes con las dosis a emplear de la preparación patrón.

Potencia asignada - Es la potencia de la preparación estándar.

Relación de Potencias - Es la razón de dosis equipotentes de la preparación patrón y la preparación muestra, bajo las condiciones del ensayo.

Potencia estimada - Es la potencia a partir de los datos del ensayo.

Preparar una solución madre del estándar disolviendo una cantidad previamente secada, si fuera necesario, y exactamente pesada de la Sustancia de referencia correspondiente. Diluir con el solvente especificado en la Tabla 1 hasta obtener la concentración indicada. Almacenar la solución en un refrigerador y emplearla dentro del período de uso indicado. En el día del ensayo preparar, a partir de la solución madre del estándar, tres o más diluciones en progresión geométrica empleando el diluyente especificado.

Se debe asumir una potencia por unidad de peso o volumen de acuerdo con la información disponible de la preparación muestra. Bajo esta hipótesis se debe preparar en el día del ensayo una solución madre de la muestra y tres o más diluciones en progresión geométrica equipotentes con las preparadas de estándar como se especifica para cada antibiótico. Emplear los mismos diluyentes que se indican para la Sustancia de referencia.

Se recomienda emplear preferentemente cepas de colección, las que se repicarán periódicamente en medios apropiados para el mantenimiento de los microorganismos según se indica en la Tabla 3. De ser posible, las cepas deben ser liofilizadas para su mejor conservación. El microorganismo a emplear con cada antibiótico se especifica en la Tabla 2.

Preparación de la suspensión y estandarización - El microorganismo a emplearse se repica en tubos de ensayo que contengan el medio apropiado solidificado en forma inclinada y se incuba a tiempo y temperatura apropiados. Una vez desarrollados los microorganismos:

a- Para el caso de ensayo en placa: suspenderlos con el agregado de Solución fisiológica (SR) estéril y la ayuda de perlas de vidrio estériles obteniendo así la suspensión original.

b- Para el caso de ensayo en tubo: tomar una ansada del cultivo, inocular 100 ml de medio líquido e incubar durante 16 a 24 horas a temperatura apropiada obteniendo así la suspensión original.

La suspensión original (a) se estandariza espectrofotométricamente efectuando la dilución indicada en la Tabla 3 en Solución fisiológica (SR) estéril, a 580 nm, llevándola a una transmitancia de 25%, pudiendo ser necesario ajustar la suspensión original y empleando Solución fisiológica (SR) como blanco. Si se prepara la suspensión original (b), se emplea como blanco una porción del mismo medio líquido sin inocular.

Preparación de la suspensión de esporas y estandarización - Repicar los microorganismos en tubos de ensayo que contengan el medio apropiado solidificado en forma inclinada. Incubar de 16 a 24 horas a una temperatura de 32 a 35°C. Suspender el desarrollo del microorganismo así en Solución fisiológica (SR) estéril con la ayuda de perlas de vidrio estériles. Transferir la suspensión proveniente de los tubos de repique a una botella de Roux que contenga 250 ml del Medio 32 y dispersar sobre toda la superficie con ayuda de las perlas de vidrio estériles. Incubar de 5 a 7 días a una temperatura de 32 a 35 °C.

El cultivo así obtenido se suspende en 50 ml de agua estéril y se calienta a 65°C durante 30 minutos en un baño termostatizado para eliminar las formas vegetativas. Centrifugar a 3000 rpm. durante 20 minutos y descartar el sobrenadante. Repetir este procedimiento no menos de tres veces, a partir del agregado de Agua purificada estéril. Luego de la última centrifugación, descartar el sobrenadante, resuspender y llevar nuevamente a 65°C durante 30 minutos. Las esporas así preparadas y almacenadas a una temperatura de 2 a 8°C tienen una vida útil aproximada de 6 meses. Verificar el rendimiento del proceso con coloración para esporas y Gram (aproximadamente 80% de formación de esporas).

Debe realizarse un ensayo en placa para asegurar la viabilidad de las esporas y determinar el volumen de suspensión de esporas a agregar por cada 100 ml de medio de cultivo.

Para ambos métodos de valoración, determinar por medio de ensayos preliminares el volumen de suspensión original a emplear como inóculo cada 100 ml de medio de cultivo, comenzando con el volumen sugerido en la Tabla 3, de modo tal que se obtengan como respuesta las zonas de inhibición claramente definidas y de diámetro conveniente o una turbidez apropiada a las diferentes dosis de Sustancia de referencia.

Procedimiento - De acuerdo con el antibiótico a valorar, fundir una cantidad suficiente de medio de cultivo estéril según se indica en la Tabla 3, enfriar a temperatura apropiada (por ej., entre 45 y 50°C para las formas vegetativas), inocular el medio y agitar por rotación hasta lograr una suspensión homogénea.

Emplear placas de Petri o bandejas rectangulares de fondo plano y, trabajando sobre una superficie plana y horizontal, verter en las placas un volumen determinado de medio inoculado para formar una capa uniforme de 2 a 5 mm de espesor. Alternativamente, el medio puede estar formado por dos capas, aunque sólo se inocule la superior.

Para algunos microorganismos de ensayo, el procedimiento puede mejorarse si las placas inoculadas se dejan secar durante 30 minutos antes de ser empleadas o si se refrigeran a 4°C durante varias horas.

Los reservorios empleados generalmente son cilindros estériles de porcelana, de acero inoxidable o de cualquier otro material apropiado, discos estériles de papel o pocillos excavados en el agar. El volumen que se carga en los reservorios debe ser uniforme y con una tolerancia máxima de 5%.

Emplear los solventes y las soluciones reguladoras indicadas en la Tabla 1 para preparar las soluciones de la Sustancia de referencia y las del antibiótico a ensayar. Para asegurar la validez de la valoración, emplear por lo menos tres concentraciones diferentes de la Sustancia de referencia y tres concentraciones del antibiótico a ensayar que presumiblemente tengan la misma actividadque las soluciones de la Sustancia de referencia. Se deben emplear series de concentraciones en progresión geométrica para aplicar el método estadístico (ver Cálculos).

Distribuir la diluciones. en cada placa de Petrio en cada placa rectangular, según un plan estadísticamente apropiado. En el caso de placas pequeñas que no pueden contener más de seis diluciones, alternar las diluciones del antibiótico y las diluciones de la Sustancia de referencia, con el fin de evitar cualquier interacción entre las diluciones de mayor concentración.

Las placas de Petri deben incubarse sin invertirla temperatura indicada ± 0,5°C durante 18 horas aproximadamente. Es aconsejable un período de predifusión antes de la incubación, que puede oscilar de 30 minutos a 4 horas, a temperatura ambiente o próxima a 4°C, según el caso, esto tiene por finalidad reducir los efectos de desfasaje de tiempo entre la aplicación de las diferentes soluciones sobre las placas y así mejorar la recta de regresión o bien obtener halos mayores y más nítidos.

Empleando un instrumento de medición apropiado, medir el diámetro de cada halo con una precisión de hasta la décima de mm. Calcular la actividad empleando métodos estadísticos apropiados (ver Cálculos). Emplear el suficiente número de replicas por concentración de antibiótico en cada ensayo (no menos de cuatro placas) para asegurar la precisión estadística.

Procedimiento - Inocular un volumen de medio de cultivo preferentemente conservado a una temperatura de 2 a 8 °C, con un volumen determinado de suspensión original estandarizada del microorganismo apropiado y emplearlo inmediatamente.

Para preparar las soluciones de la Sustancia de referencia y las soluciones del antibiótico a ensayar en concentraciones que se consideren iguales, emplear los solventes y las soluciones reguladoras indicadas en la Tabla 1.

En tubos de ensayo estériles e idénticos, transferir volúmenes iguales de cada solución y agregar el mismo volumen de medio de cultivo inoculado a cada uno de ellos (como por ej., 1 mI de solución y 9 ml de medio).

Preparar simultáneamente dos tubos control que contengan cada uno 9 ml de medio de cultivo inoculado y 1 ml de solvente empleado (sin antibiótico). Agregar inmediatamente a uno de ellos 0,5 ml de formaldehído diluido. Este tubo será empleado como blanco y sirve para calibrar el espectrofotómetro. El tubo restante, constituye el testigo de crecimiento que se emplea para determinar la finalización de la incubación.

Para asegurar la validez de la valoración, emplear por lo menos tres concentraciones diferentes de la Sustancia de referencia y tres concentraciones del antibiótico a ensayar que presumiblemente tengan la misma actividad que las soluciones de la Sustancia de referencia. Se deben emplear series de concentraciones en progresión geométrica para aplicar el método estadístico (ver Cálculos).

Ubicar todos los tubos, distribuidos al azar, en cuadrado latino o en bloques aleatorios, en un baño de agua a 37°C (28°C para Candicidina). Tomar precauciones para asegurar una distribución homogénea del calor e idéntico tiempo de incubación, generalmente de 2 a 4 horas.

Luego de la incubación, detener la multiplicación de los microorganismos por adición al azar de 0,5 ml de formaldehído diluido a cada tubo, excepto a los tubos rotulados como blanco. Medir la turbidez del contenido de cada tubo con un espectrofotómetro apropiado, a 530 nm. Calcular la actividad empleando los método estadísticos apropiados (ver Cálculos).

En cada ensayo, emplear el número de replicas por concentración de antibiótico (no menor de cuatro tubos) para asegurar la precisión estadística.

[NOTA: el procedimiento para ambos métodos, debe realizarse en condiciones asépticas].

Curva Dosis-Respuesta -

Para comprobar si cualquier ensayo en particular se esta realizando por el modelo de rectas paralelas, es necesario examinar, previo a la realización de ensayos de rutina, la relación dosis res puesta del componente activo. Cuando la diferencia entre la relación del logaritmo de la dosis y la respuesta de la preparación patrón, se desvía notablemente del efecto teórico, el modelo de rectas paralelas no es válido para este ensayo en particular. Debe verificarse que en el intervalo de dosis empleado en los ensayos, la relación entre el logaritmo de dosis y la respuesta; es representada por una recta de adecuada regresión y linealidad, con una probabilidad de 0,05.

Diseños de ensayo -

La asignación de las unidades experimentalesa los diferentes tratamientos pueden realizarse de distintas formas.

Diseño completamente aleatorio - Si la totalidad de las unidades experimentales parece ser razonablemente homogénea, sin indicación alguna de que la variabilidad de la respuesta sea distinta dentro de ciertos subgrupos reconocibles la asignación de las unidades a los diferentes tratamientos debe hacerse aleatoriamente.

Diseño en bloque aleatorio - En este diseño, es posible segregar una fuente identificable de variación, tal como la variación entre placas de Petri en un ensayo microbiológico por difusión. El diseño requiere que todos los tratamientos se apliquen el mismo número de veces en cada bloque (placa de Petri) y es apropiado solamente cuando el bloque es lo suficientemente grande como para acomodar todos los tratamientos.

Diseño de cuadrado latino - Este diseño es apropiado cuando la respuesta puede verse afectada por dos fuentes diferentes de variación, cada una de las cuales puede asumir k niveles o posiciones diferentes. En un ensayo en placa de un antibiótico, los tratamientos pueden disponerse en una serie de k x k sobre una placa grande, realizándose cada tratamiento una vez en cada fila y en cada columna. El diseño es apropiado cuando el número de filas, el número de columnas y el número de tratamientos son iguales.

El ensayo es estadísticamente válido si el resultado del análisis de la varianza cumple como mínimo con los siguientes requisitos:

1- Regresión: debe ser significativa para un valor de p £ 0.05. El estadístico F calculado debe ser mayor que el F que figura en la tabla de Fischer para un valor de a £ 0.05 para los grados de libertad correspondientes al numerador y denominador del estadístico F calculado.

2- Desvío del paralelismo: debe ser no significativo para un valor de a ³ 0.05. El estadístico F calculado debe ser menor que elF que figura en la tabla de Fischer para un valor de a ³ 0.05 para los grados de libertad correspondientes al numerador y denominador del estadístico F calculado.

3- Desvío de la linealidad: debe ser no significativa para un valor de p ³ 0.05. EI estadístico F calculado debe ser menor que el F que figura en la tabla de Fischer para un valor de a ³ 0.05 para los grados de libertad ...... correspondientes al numerador y denominador del estadístico F calculado.

Sólo una vez que se ha demostrado la validez estadística del ensayo puede calcularse la potencia de la preparación desconocida y sus intervalos de confianza aplicando los cálculos que se describen en Cálculos.

[Nota: para ambos métodos de valoración, si la potencia calculada es menor de 80% o mayor de 125% que la supuesta para el producto o antibiótico analizado, ajustar las concentraciones de las soluciones muestra hasta alcanzar igual actividad supuesta que las soluciones de referencia y repetir la valoración].