En su aplicación a la industria farmacéutica, la Biotecnología se refiere al empleo de organismos vivos para la obtención de biofármacos. El objetivo de este documento está dirigido al empleo de la llamada Biotecnología de ADN recombinante, apoyada fundamentalmente en dos grandes avances tecnológicos.

Uno de ellos está representado por el empleo de las técnicas de ADN recombinante, ADNr (ingeniería genética), las cuales permiten transplantar genes de una especie en otra especie distinta. De esta manera, genes que codifican para la expresión de proteínas (generalmente humanas) pueden ser insertados en células hospedadoras procariotas o eucariotas, de tal forma que la célula hospedadora exprese grandes cantidades de la proteína deseada.

El otro avance se refiere al desarrollo de las técnicas que permiten obtener y emplear anticuerpos monoclonales: tecnología de hibridoma y líneas celulares transformadas.

Otras tecnologías, como las que permiten obtener plantas y animales transgénicos, la terapia genética y la tecnología de ADN antisentido, no están contempladas en este capítulo. El esquema regulatorio general para productos biotecnológicos es el mismo que para productos del mismo tipo obtenidos por métodos tradicionales, con el agregado de requerimientos específicos propios de su origen biotecnológico.

La finalidad de este capítulo es considerar los criterios para la elaboración y control de productos obtenidos a través de técnicas biotecnológicas.

El progreso de la genética molecular (biología molecular) y de la química de los ácidos nucleicos hizo posible identificar genes que codifican para proteínas biológicamente activas. Estos avances han permitido analizar esos genes en gran detalle y transferirlos de un organismo a otro a fin de obtener la expresión de los mismos en condiciones reguladas mediante una síntesis suficiente de los polipéptidos correspondientes.

Un gen se caracteriza por una secuencia particular de nucleótidos en la molécula de ADN. Cuando se separan las dos cadenas, cada una de ellas forma un molde para la síntesis de una copia complementaria y constituye un mecanismo para la reproducción fiel de los genes, conservando al mismo tiempo la secuencia lineal de los cuatro mononucleótidos que constituyen los componentes básicos. El proceso de decodificación de esta información y la síntesis del producto recombinante se cumplen en dos etapas: 1) la transcripción de la cadena del ADN que lleva la información genética en forma de ARN mensajero, ARNm y 2) la traducción de la información que porta la molécula de ARNm a un polipéptido.

Los avances científicos han permitido el empleo industrial de microorganismos o células transformadas mediante la inserción de un gen heterólogo, para la producción de proteínas de interés en diversos campos y en especial en el área de la salud humana.

Esta tecnología permite no sólo reproducir proteínas idénticas a las naturales, sino también elaborar proteínas modificadas y aún totalmente nuevas, mediante las alteraciones correspondientes en los genes a insertar. Es decir, proporciona la posibilidad de manejar este potencial para lograr moléculas iguales o más ventajosas que las naturales para una determinada función, como por ej., mayor actividad biológica, mayor vida media, menos efectos colaterales, etc. Sin embargo, hay que tener en cuenta que tales modificaciones estructurales con respecto a la proteína natural pueden potencialmente despertar, en el paciente tratado, una respuesta inmune o nuevos efectos adversos que invalidarían su aplicación. Cabe aclarar que en caso de obtenerse un producto ventajoso dentro de esta categoría (línea) éste deberá ser evaluado en función de una relación beneficio riesgo.

Un gen de origen natural, un ADN copia, ADNc, o una secuencia de nucleótidos obtenida por síntesis, que codifique para un determinado producto, puede propagarse insertándose en un vector apropiado. Se emplean con este fin enzimas muy específicas denominadas endonucleasas de restricción (que causan la segmentación del ADN del vector en sitios preestablecidos) y ligasas (que unen el ADN insertado al vector), luego de lo cual el vector se introduce en un organismo hospedador apropiado.

El siguiente paso corresponde a la incorporación del vector modificado en la célula hospedadora elegida, siguiendo la selección de los clones que han incorporado la información genética apropiada para la elaboración del producto.

La etapa siguiente se refiere al desarrollo de un sistema de propagación en cultivo masivo, en forma tal de obtener una expresión eficiente del producto recombinante deseado.

La elección del organismo hospedador, sea éste procariota (bacteria) o eucariota (células de mamíferos, levaduras), es la resultante de diversos factores que abarcan desde la complejidad de la molécula a producir hasta la economía y eficiencia del proceso de fermentación o cultivo celular.

El profundo conocimiento sobre la biología molecular de Escherichia coli, hizo que inicialmente fuese elegido este microorganismo en diversos sistemas de producción en biotecnología.

Actualmente también existen en el mercado diversos productos obtenidos por medio de cultivos de células eucariotas modificadas genéticamente en gran escala, para diversos procesos biotecnológicos productivos.

Por lo tanto, podemos agrupar los procesos biotecnológicos de acuerdo al organismo productor seleccionado en:

A - Sistemas biotecnológicos procarióticos (bacterias).

B - Sistemas biotecnológicos eucarióticos (células de mamíferos y levaduras).

Los factores que influyen en la expresión de genes extraños introducidos en un nuevo hospedador son múltiples y muy complejos. Por lo tanto, los procesos de este tipo deberán estar diseñados para garantizar y controlar la estabilidad de toda la construcción genética insertada fin de asegurar la homogeneidad y uniformidad de la proteína producida por el hospedador a lo largo de múltiples generaciones.

El plásmido recombinante es el elemento clave de esta tecnología. Contiene el gen previamente aislado que codifica para la proteína de interés. Los plásmidos están formados por ADN bacteriano, son circulares, pequeños, extracromosomales y se autorreplican.

Básicamente, esta tecnología involucra el clivado enzimático específico del plásmido bacteriano y la posterior inserción del gen de interés. De esta manera se obtiene el plásmido recombinante que al ser introducido en el microorganismo hospedador, mediante el proceso de transformación le confiere la propiedad de dirigir u orientar la síntesis de la proteína deseada.

La expresión de proteínas recombinantes en bacterias ofrece tanto ventajas como inconvenientes. Como se mencionó anteriormente la biología y fisiología bacterianas se conocen en profundidad y existe amplia documentación que demuestra el seguro y eficaz empleo de bacterias como organismo hospedador.

Los productos procedentes de genes heterólogos expresados en hospedadores extraños pueden diferir de sus equivalentes naturales desde el punto de vista estructural, biológico o inmunológico. Esas diferencias pueden surgir ya sea en el nivel genético, con posterioridad a la traducción o a la transcripción o durante el proceso de fermentación y de purificación.

Por lo tanto, estos sistemas poseen limitaciones, algunas de las cuales se enumeran a continuación:

a) La proteína biosintetizada en el interior de la célula se encuentra en un estado químicamente reducido, sin la presencia de los correspondientes puentes disulfuro que estabilizan la estructura espacial de la molécula nativa.

Es necesario efectuar in vitro, en condiciones perfectamente definidas y controladas, la oxidación que posibilite la formación de los puentes disulfuro intramoleculares y en consecuencia la estabilización de la estructura molecular terciaria.

De formarse sustancias no deseadas (oligómeros, puentes disulfuro intermoleculares y/o erróneos, etc.) las mismas deberán ser eliminadas en el proceso de purificación. Además es fundamental controlar la presencia de estas formas moleculares en el producto final.

b) Todas las proteínas producidas por bacterias comienzan su secuencia de aminoácidos con un residuo de N-formil-metionina, el que no siempre es eliminado por los sistemas enzimáticos específicos (metilamino peptidasa-MAP), por lo que la proteína resultante podría iniciar su secuencia con esta modificación respecto a la proteína nativa.

Los avances en la biología molecular de la Escherichia coli han conducido a la obtención de la expresión de proteínas en el espacio periplásmico de la bacteria. Esta forma de expresión permite la remoción de la metionina N-terminal no deseada y la obtención de proteínas en mayor grado de pureza.

c) Durante el proceso de fermentación bacteriana y en la etapa de aislamiento y purificación posterior (downstream) debe controlarse la acción proteolítica de exo y endo-proteasas bacterianas, a fin de evitar la degradación de la proteína recombinante.

d) Es necesario controlar la acción de las deamidasas bacterianas que al hidrolizar residuos de glutamina o asparagina dan lugar a la formación de isoformas ácidas, con el correspondiente cambio de estos aminoácidos a ácido glutámico y ácido aspártico, respectivamente.

e) Como las endotoxinas son lipopolisacáridos producidos por microorganismos Gram (-) es necesario eliminar durante la purificación importantes cantidades de estas sustancias.

f) Las bacterias carecen de sistemas enzimáticos capaces de glicosilar proteínas, pudiendo en determinadas ocasiones llegar a dar como resultado moléculas de baja actividad biológica in vivo, menor solubilidad, baja vida media y alta antigenicidad. Por lo tanto, esto deberá tenerse en cuenta si se desea producir una proteína que sea naturalmente glicosilada y en la cual su patrón de glicosilación esté comprometido con las características farmacológicas de la proteína.

Líneas celulares de mamíferos - Se ha establecido en la industria farmacéutica el empleo de cultivo de células de mamíferos para la producción de vacunas y se cuenta con la información necesaria para asegurar la adecuación de estos productos en medicina humana. Como extensión de esta tecnología se desarrollaron procesos productivos basados en el cultivo masivo de células transformadas de mamíferos, tratando de dar respuesta a las limitaciones productivas de las bacterias.

Las células eucariotas tienen la capacidad de glicosilar las proteínas que sintetizan, las que usualmente son exportadas al medio con sus estructuras primaria, secundaria y terciaria similares a las proteínas nativas humanas.

Basado en la preocupación existente por la potencial presencia de oncogenes y posibles contaminaciones virales y retrovirales, es necesario contar con líneas inmortales, feno y genotípicamente caracterizadas que aseguren la estabilidad del proceso, además del exhaustivo análisis y caracterización de los bancos maestros celulares que permitan así, en su conjunto, minimizar este riesgo potencial.

Otras células eucariotas - Es posible también lograr muchas de las ventajas conformacionales y post- transcripcionales descritas empleando otras células eucariotas, como levaduras (como por ej., Saccharomyces cereviseae) y líneas originarias de insectos.

Estos sistemas ofrecen varias ventajas teóricas con respecto a bacterias, a la vez que generan nuevas preocupaciones. Por ej., el patrón de glicosilación es diferente al de las células de mamífero, pudiendo en determinadas ocasiones llegar a dar como resultado moléculas de baja actividad biológica in vivo, menor solubilidad, baja vida media y alta antigenicidad. Por lo tanto, esto deberá tenerse en cuenta si se desea producir una proteína que sea naturalmente glicosilada y en la cual su patrón de glicosilación esté comprometido con las características farmacológicas de la proteína.

Producción de anticuerpos monoclonales - Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos en dos formas, según sea su origen murino o humano.

En el caso de los anticuerpos monoclonales murinos, se fusionan linfocitos provenientes del bazo de ratones previamente inmunizados, con una línea celular inmortal de ratón (mieloma). Los hibridomas así obtenidos son posteriormente seleccionados y clonados.

Para la producción de anticuerpos monoclonales humanos se seleccionan por su especificidad inmunológica linfocitos B humanos, los que son inmortalizados.

La célula resultante fusionada o transformada podrá proliferar indefinidamente en un biorreactor o cultivo celular o podrá ser inyectada en ratones a partir de cuyo líquido ascítico se podrá aislar la proteína.

En todos estos casos los anticuerpos deberán ser tratados como productos obtenidos en células de mamíferos.

En algunas circunstancias se puede recurrir a la humanización de anticuerpos murinos y los mismos deberán ser considerados de acuerdo al sistema de producción como productos recombinantes.

La principal diferencia entre los productos farmacéuticos tradicionales y los biotecnológicos radica en que estos últimos son producidos por organismos vivos modificados genéticamente. En esta categoría se incluyen tanto las proteínas o polipéptidos derivados de ADN recombinante, como así también los anticuerpos monoclonales. Los productos biotecnológicos se diferencian de aquellas proteínas y polipéptidos obtenidos de fuentes naturales o resultantes de la síntesis química únicamente por su método de obtención.

En las etapas de elaboración estrictamente galénicas todos los productos farmacéuticos, inclusive los de origen biotecnológico, comparten plenamente los mismos requisitos básicos para la validación de procesos, el control ambiental, la elaboración aséptica y los sistemas de control de calidad. Sin embargo, los sistemas biotecnológicos presentan con frecuencia un mayor grado de complejidad en las etapas de elaboración propiamente dicha.

Los productos derivados del ADN recombiante pueden contener contaminantes potencialmente perjudiciales que normalmente no se hallan presentes en los equivalentes preparados con los métodos ordinarios y en consecuencia el proceso de purificación debe ser capaz de eliminarlos. Son ejemplos de ello las endotoxinas en productos expresados en células bacterianas, y el ADN celular y virus contaminantes en los derivados de células animales.

Preocupa especialmente la contaminación con ácido nucleico procedente de células transformadas de mamíferos debido a la posible presencia de ADN potencialmente oncogénico. El procedimiento de elaboración elegido condicionará la naturaleza y el nivel de los posibles contaminantes.

La posible variabilidad del sistema durante la elaboración puede llevar a modificaciones que favorezcan la expresión de otros genes en el sistema hospedador-vector o que produzcan menor rendimiento del producto o diferencias cuantitativas y cualitativas de las impurezas presentes. La producción de cultivos continuos es objeto de consideraciones similares.

Es indispensable, por lo tanto, contar con procedimientos que aseguren la uniformidad de las condiciones de elaboración y del producto final.

A modo de generalización, los procesos de elaboración biotecnológicos incluyen las siguientes etapas:

Etapa de expansión celular (upstream) - Consiste en la obtención de una gran masa del organismo elaborador a través de los procesos de fermentación bacteriana o cultivo celular masivo, al fin de los cuales se cuenta con la biomolécula impura y en condiciones de pH, fuerza iónica, estado de agregación, etc., que deben ser modificadas para su posterior procesamiento.

Purificación (downstream) - Encadenamiento lógico de procesos que, partiendo del material anterior, debe producir una molécula del grado de pureza requerido, conservando plenamente su actividad biológica y terapéutica. El proceso de downstream debe asegurar que el producto cumpla todos los criterios de aceptabilidad para ser empleado como principio activo.

Es posible agrupar los diferentes pasos que conforman el downstream en dos grandes etapas: Recuperación y Purificación.

Recuperación - Mediante el empleo de diversas metodologías (micro y ultrafiltración, centrifugación, precipitación salina o con solventes, diafiltración, rotura celular, extracción en dos fases o con solventes, etc.), el material proveniente del proceso de upstream es llevado a condiciones previamente definidas, obteniéndose la materia prima cruda (principio activo de baja pureza) para su posterior purificación.

Purificación - La materia prima cruda se purifica, mediante diversos métodos, como por ej., cromatografía líquida de inmuno-afinidad, intercambio fónico, exclusión molecular, interacción hidrofóbica, enfoque y en fase reversa. El material resultante puede ser denominado principio activo puro o materia prima pura.

Acondicionamiento - Como ocurre con cualquier principio activo, la materia prima pura debe ser acondicionada para lograr un producto semielaborado (granel) que respete todos los requisitos correspondientes a un producto farmacéutico.

Estas consideraciones abarcan las siguientes áreas:

1. Los materiales iniciales, incluidos los datos básicos de la célula hospedadora y del origen, naturaleza y secuencia del gen empleado en la producción.

2. Su proceso de elaboración.

3. La materia prima pura.

Los productos derivados del ADN recombinante y de la tecnología de hibridoma (anticuerpos monoclonales) se consideran similares a las sustancias biológicas producidas por los métodos tradicionales, como las vacunas bacterianas y virales, en las que el control apropiado de los materiales iniciales y del procedimiento de fabricación es tan necesario como el del producto mismo.

Estas consideraciones, por tanto; ponen énfasis en los controles durante la preparación para asegurar la inocuidad y eficacia del producto y en la caracterización integral del producto.

También se considera esencial la validación del proceso de fabricación, así como la del procedimiento de purificación para eliminar los materiales no deseados.

Se deben tener en cuenta las normas generales para el control de la calidad de los productos biotecnológicos, por tanto, habrá que prestar especial atención a la calidad de todos los reactivos empleados en la elaboración, incluidos los componentes de los medios de fermentación y cultivo. Si se emplean aditivos de origen animal ( como por ej., suero fetal bovino) se debe demostrar que están exentos de agentes adventicios.

No es conveniente emplear en la producción ningún agente que se sabe provoca reacciones alérgicas en ciertos individuos, como penicilina u otros antibióticos betalactámicos.

Los productos biotecnológicos deben satisfacer las normas generales para el control de la calidad de los productos biológicos, como ensayos de actividad, toxicidad, piretógenos, estabilidad y esterilidad, además de controles que aseguren la identidad y pureza de la molécula obtenida comparándola contra una de referencia, así como un conjunto de ensayos que verifiquen su integridad, grado de agregación, secuencia correcta de aminoácidos, etc.

Las consideraciones para un producto deben reflejar, además, el uso clínico al que se lo destina. Así, una preparación que ha de administrarse en forma reiterada por un largo período de tiempo, o en grandes dosis, probablemente necesite someterse a minuciosos ensayos para investigar la presencia de vestigios de contaminantes antigénicos, lo que puede ser menos estricto para un producto que se aplica una sola vez (como por ej. una vacuna). ,

Se deben fijar límites máximos permisibles, para impurezas y contaminantes que pueden estar presentes en estos productos, adecuando los límites, de acuerdo con el avance tecnológico.

La tecnología de ADN recombinante comprende el reordenamiento sistemático y la manipulación de segmentos específicos de ácido nucleico para la construcción de genes circulares o plásmidos, las cuales, cuando son introducidas en un hospedador apropiado, darán origen a la molécula deseada.

Existen en general tres métodos para la obtención de un segmento codificante específico:

1. Transcripción reversa del ARN a ADNc;

2. Aislamiento del ADN genómico;

3. Síntesis química.

Se debe proveer información lo más detallada posible respecto de:

Caracterización de la célula hospedadora (eucariota o procariota), incluyendo origen, fenotipo, genotipo y descripción del medio de cultivo.

En el caso de emplearse células eucariotas cono hospedadoras debe proveerse la historia de la línea celular y las características generales de la misma.

Deben determinarse el patrón de crecimiento y el aspecto morfológico de la línea celular, que debe ser estable desde el banco celular maestro hasta el final de la elaboración. Si existiesen marcadores específicos que puedan ser útiles en la caracterización de la línea celular (como cromosomas marcadores, marcadores específicos de superficie), éstos deben ser caracterizados para determinar la estabilidad de la misma.

Si las células tienen una expectativa de vida finita, debe determinarse el número total de duplicaciones de la población hasta el envejecimiento.

Documentación respecto de la estrategia de clonado del gen y caracterización del vector recombinante, incluyendo:

1. Origen, caracterización del gen clonado y análisis de la secuencia nucleotídica del mismo.

2. Análisis de la secuencia nucleotídica de las regiones de control adyacentes al vector de expresión. Es conveniente incluir una explicación del origen y función de las partes componentes del vector, como los orígenes de replicación, marcadores de resistencia a antibióticos; promotores, secuencias moduladoras (enhancers), si el producto ha de ser sintetizado o no como una proteína de fusión, como así también un mapa de digestión con enzimas de restricción, indicando al menos aquellos sitios empleados en la construcción.

3. Construcción genética, estructura del vector de expresión completo y mapa de restricción.

Caracterización del sistema hospedador-vector, incluyendo:

1. Mecanismo de transferencia del vector a la célula hospedadora (transfección, infección, microinyección, etc.).

2. Número de copias, estado físico (integrado o extracromosomal) y estabilidad del vector en la célula hospedadora.

3. Métodos empleados para promover y controlar la expresión.

Una vez que se ha elegido una línea celular como fuente biológica de un producto, se debe generar un sistema de banco de células para garantizar que exista una fuente apropiada de células equivalentes para emplear a través del lapso de vida del producto.

Usualmente existe un banco celular maestro (BCM) y un banco celular de trabajo (BCT). Los bancos celulares pueden ser tanto de células eucariotas como procariotas.

Además de proveer una fuente constante de material de partida, las ventajas de un sistema de bancos celulares incluyen la capacidad de contar con una detallada caracterización de la línea celular y una disminución de las posibilidades de contaminaciones con otras líneas celulares o con otros microorganismos.

Banco celular maestro (BCM) - Es una suspensión homogénea de células originales ya transformadas con el vector de expresión conteniendo el gen deseado, la cual es distribuida en volúmenes iguales dentro de recipientes individuales en condiciones definidas (como por ej., en nitrógeno líquido).

En algunos casos puede ser necesario establecer BCM separados para el vector de expresión y la célula hospedadora. Se deben documentar cuidadosamente la localización, identificación e inventario de las ampollas individuales.

Se deben realizar todos los ensayos de identidad del BCM necesarios para establecer las propiedades significativas de las células (marcadores fenotípicos y genotípicos relevantes) y la estabilidad de esas propiedades a través del tiempo. Deben proveerse datos demostrando que las células pueden ser empleadas para el propósito deseado. También deben obtenerse datos para demostrar el número de copias e identidad del sistema de expresión, la calidad y cantidad de la proteína que éste produce.

Debe confirmarse la secuencia de nucleótidos del gen clonado en el estado de BCM. Sin embargo, en ciertos casos, como cuando se insertan copias múltiples del gen clonado en el genoma de una línea celular continua, la secuenciación puede ser inapropiada. En tales circunstancias, puede ser útil realizar un análisis de Southern blot sobre el ADN celular total o bien el análisi de Nolhern blot o de la secuencia del ARNm.

Si fuera necesario generar un nuevo BCM por transferencia de la construcción de expresión en células hospedadoras seguida por una selección de las células clonadas deseadas, se deben describir los criterios de aceptación que permitan garantizar la identidad del clon y la proteína producida en referencia a la original.

Banco celular de trabajo (BCT) - Es una suspensión homogénea de células derivadas del BCM luego de un número definido de pasajes, distribuida en volúmenes iguales dentro de recipientes individuales para su almacenamiento (como por ej., en nitrógeno líquido). La localización, identificación e inventario de las ampollas individuales deben ser cuidadosamente documentados.

Para la elabaracrón de un lote de producto biológico pueden ser empleados uno o más recipientes del BCT. Si se emplean células de más de un recipiente, las suspensiones celulares deberán ser mezcladas en el momento de descongelarlas. El nivel de duplicación de la población de las células empleadas para la elaboración se basará en criterios escritos establecidos por el elaborador asegurando la integridad del sistema célula - producto.

En ambos bancos:

- Todos los recipientes deberán ser tratados de la misma manera durante el almacenamiento y, una vez retirados del lugar de depósito de células, los mismos deberán ser descargados.

- Se recomienda que cada uno de los BCM y BCT sean almacenados en dos o más áreas lo suficientemente separadas dentro de las instalaciones de producción, así como en un sitio distante para evitar la érdida de la línea celular.

Un banco celular puede ser empleado para la elaboración en Cultivos con número definido de pasajes o bien en Cultivos continuos.

Cultivos con número definido depasajes

Este método de cultivo es definido por un número definido de pasajes o duplicaciones de la población, el cual no debe ser superado durante el proceso de elaboración. Se debe definir el máximo número de duplicaciones, o pasajes, durante los cuales rutinariamente el proceso de elaboración cumple con los criterios expresados más arriba.

Deberán describirse en detalle los procedimientos y materiales empleados para la propagación de las células y para la inducción del producto. En cada tanda de elaboración se deben suministrar datos sobre el alcance y naturaleza de cualquier contaminación microbiana de los recipientes de cultivo inmediatamente antes de la recolección, indicándose la sensibilidad de los métodos empleados para detectarla.

Se deben presentar datos sobre la uniformidad de las condiciones de fermentación y de la propagación de los cultivos sobre el mantenimiento del rendimiento del producto. Se deben establecer los criterios que han de aplicarse para descartar lotes de cultivo. Se debe determinar el número máximo de duplicaciones celulares o cantidad de pasajes permitidos durante la elaboración.

Se deben observar las características de la célula hospedadora y el vector al final de los ciclos de elaboración. De ser pertinente, se debe determinar la secuencia de nucleótidos de la inserción que codifica el producto derivado del ADN clonado, por lo menos una vez después del cultivo en gran escala de cada lote de siembra inicial.

Cultivos continuos - A través de este método el número de pasajes o duplicaciones de la población no está definido ni restringido desde el comienzo de la elaboración. El elaborador debe definir los criterios adoptados tanto para la cosecha celular como para la terminación del proceso de elaboración. Durante la etapa de cultivo, el mismo debe ser monitoreado, la frecuencia y el tiempo de monitoreo requerido dependen de la naturaleza del sistema de elaboración y del producto. El elaborador debe definir e informar los sistemas de monitoreo adoptados.

Debe aportarse información referente a la integridad del gen que está siendo expresado y a las características fenotípicas y genotípicas de la célula hospedadora luego de un tiempo prolongado de cultivo. De ser pertinente, se debe determinar la secuencia de nucleótidos de la inserción que codifica el producto derivado del ADN clonado, por lo menos una vez después del cultivo en gran escala de cada lote de siembra inicial. Sin embargo, en ciertos casos, como cuando están insertadas múltiples copias del gen clonado en el genoma de una línea celular continua, secuenciar el gen clonado puede ser inapropiado.

En tales circunstancias, puede ser útil un análisis de Southern blot sobre el ADN celular total o bien el análisis de Nothern blot o realizar la verificación de la secuencia del ARNm; en esos casos debe tenerse una atención particular en la caracterización del producto final.

Además se debe contar con datos que demuestren que las variaciones en el rendimiento no sobrepasen los límites establecidos. La aceptación de suspensiones para más operaciones debe estar claramente vinculada al programa de control adoptado y se requiere contar con una definición clara del lote del producto que se ha de someter a más operaciones.

También se deben establecer los criterios para descartar suspensiones y/o suspender los cultivos. Se deben efectuar ensayos sistemáticos para investigar la contaminación microbiana de acuerdo con la estrategia de recolección.

Se debe especificar el período máximo de cultivo continua, basándose en la información sobre la estabilidad del sistema y la uniformidad del producto durante y después de este este período.

En los cultivos continuos prolongados, la línea y los productos celulares se evaluarán reiteradamente a intervalos determinados de acuerdo a la información obtenida sobre la estabilidad del sistema hospedador - vector y las características del producto.

Control de calidad de los bancos celulares - El control de calidad de los bancos celulares debe incluir información referente a:

1. Estabilidad a través de medidas de viabilidad y de retención del vector.

2. Identidad celular a través de su caracterización fenotípica.

3. Contar con evidencias que demuestren que los bancos celulares están libres de agentes infecciosos potenciales u oncogénicos (virus, bacterias, hongos o micoplasmas). Debe prestarse especial atención a los virus que comúnmente contaminan a la especie de la cual deriva la línea celular. Ciertas líneas celulares contienen virus endógenos, como por ej., retrovirus, cuya eliminación puede no ser factible. La expresión de estos organismos, bajo una variedad de condiciones que se conocen como causantes de su inducción, debe ser ensayada. Los lotes de siembra deben estar exentos de todo contaminante adventicio.

Este punto no corresponde en el caso de bacterias, hongos o levaduras.

4. La oncogenicidad potencial del banco celular, en el caso de células eucarióticas derivadas de mamíferos.

5. Registros fidedignos de la composición y origen de los medios de cultivo empleados para los bancos celulares.

Debido a que los sueros de animales pueden producir respuestas alérgicas en seres humanos; deben realizarse esfuerzos para reducir los niveles de suero requeridos para la propagación y elaboración en cultivos celulares tanto como sea posible. La cantidad residual de suero o aditivos en el producto final debe ser determinada y no exceder los límites establecidos.

Si en el pasaje de células se emplea tripsina porcina, debe estar libre de agentes adventicios, incluyendo parvovirus porcino.

Los elaboradores de productos biológicos deben proveer información respecto a la/s fuente/s y controles de cualquier material derivado de fuentes animales.

No deben estar presentes en los cultivos de células de elaboración, penicilina u otros antibióticos beta lactámicos. Pueden ser aceptables mínimas concentraciones de otros antibióticos o agentes inductores.

Caracterización e identificación - Los requisitos de identidad, pureza, actividad y estabilidad del producto están estrechamente relacionados con la tecnología de procesamiento empleada y las características fisicoquímicas y biológicas de un principio activo específico, debiendo tenerse en cuenta el uso previsto para el producto.

En el control de calidad de productos obtenidos por tecnología de ADN recombinante es frecuente emplear la combinación de ensayos validados para el producto final y durante el proceso para asegurar la eliminación de impurezas no deseadas hasta alcanzar los niveles requeridos por la Autoridad Sanitaria.

Resulta esencial la caracterización rigurosa del principio activo mediante métodos químicos, físicos y biológicos.

Consideraciones de Sustancias de referencia - El empleo de Sustancias de referencia es extremadamente importante en el análisis de los productos obtenidos mediante la tecnología de ADN recombinante.

Se encuentran disponibles Sustancias de referencia con unidades definidas de actividad para varios productos biológicos, provenientes de fuentes reconocidas. Se deben emplear Sustancias de referencia específicas vigentes para cada producto; dado que con el tiempo pueden ser reemplazados por los organismos que las controlan.

Contenido proteico - La cuantificación de proteínas en un producto dado es una determinación importante por sí misma y también porque los resultados de otras valoraciones, como por ej., la actividad específica, dependen del contenido proteico.

Existen varios métodos aceptados para la determinación del contenido proteico, como absorbancia ultravioleta, fluorescencia, métodos de Lowry, de Bradford y de Kjeldahl.

Análisis de aminoácidos (Identificación y/o contenido proteico).

Secuenciación proteica (Identificación) -

Amino - terminal.

Carboxilo - terminal.

Mapa Peptídico (Identificación).

Valoraciones imnunológicas.

Electrofresis -

SDS - PAGE.

Isoelectroenfoque.

Electroforesis capilar de alta resolución (HPCE).

Métodos cromatográficos -

CLAE en fase reversa.

CLAE de intercambio iónico.

CLAE de exclusión molecular.

Cromatografía de Interacción Hidrofóbica.

Determinación de ADN - El ADN residual de la célula hospedadora es una posible impureza, diferente en cada producto porque depende del organismo hospedador y del proceso de purificación.

Los niveles de ADN deben ser cuantificados empleando métodos con una sensibilidad apropiada.

Entre las técnicas empleadas pueden mencionarse:

— Hibridación en dot-blot empleando sondas específicas marcadas con 36P.

— Tecnología de biosensores.

— Tecnología de la rección en cadena de la polimerasa (PCR).

— Determinación de carbohidratos - La glicosilación (unión covalente de cadenas de oligosacáridos a la cadena peptídica) es una posible modificación posterior a la traducción de ARNm. Es característica de las proteínas recombinantes que se expresan a partir de líneas de células eucariotas.

La glicosilación puede tener influencia sobre la farmacocinética y la función de la proteína de modo que cambios en la glicosilación pueden tener impacto significativo sobre las características farmacodináinicas y la eficacia terapeútica de un producto.

La glicosilación es un indicador sensible del control del proceso.

Idealmente, un producto debería ser caracterizado, al menos una vez, en cuanto a la identificación de los sitios de glicosilación como así también del carbohidrato específico de cada sitio.

La cuantificación de los azúcares específicos y carbohidratos totales debería realizarse en cada lote. En algunos casos, el predominio de ácido siálico puede hacer del isoelectroenfoque en una técnica útil como una alternativa a la cuantificación de azúcares específicos en cada lote. Es óptimo fijar especificaciones acerca de la cantidad de cada isoforma para la liberación de los lotes como así mismo conocer la actividad específica de cada una de ellas.

Se pueden adoptar dos enfoques principales para determinar los azúcares unidos en forma covalente a la glicoproteína. Ambos dan por sentado que la microheterogeneidad es un fenómeno común entre las glicoproteínas y que la información representa correctamente la composición promedio o la estructura representativa. El primer enfoque es la determinación de la composición de azúcares unidos a una glicoproteína. El segundo es liberar y separar las estructuras de oligosacáridos individuales unidas covalentemente a la misma. Este último, permite obtener un mapa de oligosacáridos análogo al mapeo peptídico para una proteína.

Impurezas y contaminantes potenciales en productos biológicos - Los contaminantes que se pueden encontrar en la materia prima provienen básicamente de tres fuentes:

1 - Organismo hospedador: Proteínas del hospedador. ADN del hospedador.

2 - Proteínas e impurezas del proceso productivo - purificación:

3 - Impurezas relacionadas al principio activo proteína.

La pureza de una preparación proteica obtenida por tecnología de ADN recombinante debe ser máxima. Los niveles permitidos de trazas de contaminantes de cada producto serán especificados en la monografía correspondiente.

En la Tabla se describen los tipos de impurezas o contaminantes más frecuentes, indicando los métodos de detección más idóneos:

Tabla. Impurezas potenciales y/o agentes contaminantes.

Tabla - continuación. Impurezas potenciales y/o agentes contaminantes.

a. Electroforosis en gel de poliacrilamida (SDS PAGE).

b. Cromatografía líquida de alta eficacia.

c. Reacción en cadena de la polimerasa.

d. Isoelectroenfoque.

e. Cromatografía de exclusión molecular de alta resolución.

f. Fluorocromo unido a ADN.

g. Efecto citopático.

h. Hemoadsorción.

i. Producción de anticuerpos murinos.

Ensayo biológico para identidad y potencia - Los métodos para determinar la potencia de productos biológicos obtenidos por técnicas de ADN recombinante son de fundamental importancia, pues miden la actividad del producto.

La actividad biológica, expresada en unidades internacionales, debe conservar una estricta relación directa con la masa del producto. Esto significa que el efecto biológico medido (actividad) por unidad de masa debe comportase como una constante acotada dentro de límites claramente especificados y autorizados. La actividad expresada por unidad de masa se denomina actividad específica y constituye un parámetro de identidad y/o pureza.

Esenciamnete hay dos métodos para cuantificar la actividad: Análisis empleando un modelo animal y Análisis basados en cultivos de células. Para medir la masa se realizan Análisis fisicoquímicos.

Cada uno de estos métodos es de frecuente aplicación en el control de calidad de productos biológicos.

Análisis empleando un modelo animal - Los análisis biomiméticos en modelos animales han sido empleados rutinariamente, desde hace mucho tiempo, en el control de calidad de productos biológicos. A pesar de su larga historia, tienen una serie de desventajas como la necesidad de un gran número de animales de características definidas, contar con instalaciones apropiadas y personal debidamente capacitado para el manejo de los animales, largo tiempo de análisis (días semanas). Se emplean en aquellos casos donde los análisis basados en cultivos de células o en métodos fisicoquímicos no dan resultados más confiables que los biomiméticos. Se podrán emplear métodos fisicoquímicos cuando se especifique en la monografía correspondiente.

La ventaja esencial de este tipo de métodos reside en que son los únicos capaces de reflejar fielmente la integridad y apropiada disponibilidad de la molécula biológica para expresar el efecto deseado.

Análisis basados en cultivo de células (in vitro) - Los análisis basados en cultivo de células proveen información sobre el efecto del producto biológico en un sistema vivo, pero pueden dar menos información sobre el estado conformacional de la molécula (integridad y reconocimiento por receptores específicos) que cuando se utilizan animales. El hecho que estos métodos puedan ser automatizados y que puedan ser repetidos un gran número de veces permite obtener resultados reproducibles.

Los bioanálisis basados en cultivo de células pueden ser divididos en dos grupos:

a) Los que necesitan cultivos primarios, de origen humano o animal.

B) Los que requieren líneas celulares en cultivo continuo, como por ej., la medición del efecto de citoquinas, ya sea promoviendo la actividad celular o bien inhibiendo la actividad o secreción de otras citoquinas.

Análisis por métodos fisicoquímicos - Este grupo de análisis no se basa en un modelo vivo sino que, generalmente, tienen en cuenta la acción química de un producto biológico. Estos métodos son comparativamente simples, rápidos, precisos y exactos. Otra ventaja de este tipo de análisis, por su precisión y exactitud, es que pueden ser empleados para proveer resultados confiables de la estabilidad del producto. La principal desventaja de estos métodos es que pueden ser insensibles a cambios en la molécula, con la lógica divergencia con la actividad en sistemas biológicos.